Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu một số chất nguồn gốc thực vật ức chế protease của HIV-TYPE 1

Chia sẻ: Acacia2510 _Acacia2510 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

30
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu đề tài là điều tra được sự có mặt của các chất ức chế protease HIV-1 từ nguồn thực vật Việt Nam thông qua pepsin, một protease aspartyl mang những đặc điểm tương đồng trong cấu trúc cũng như cơ chế xúc tác với protease HIV-1. Thu nhận và tinh sạch được một số chất ức chế protease HIV-1 từ nguồn thực vật. Xác định được cấu trúc, tính chất và đánh giá được cơ chế tác dụng của một số chất ức chế protease HIV-1 đã thu nhận được.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu một số chất nguồn gốc thực vật ức chế protease của HIV-TYPE 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Văn Dũng NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHẤT NGUỒN GỐC THỰC VẬT ỨC CHẾ PROTEASE CỦA HIV-TYPE 1 Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62420116 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2018
Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa PGS.TS. Bùi Phương Thuận Phản biện 1: ………………... Phản biện 2: ………………... Phản biện 3: ………………... Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Quốc gia họp tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên vào hồi …giờ 00, ngày …. tháng …. năm …. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam, - Trung tâm thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội 2
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) gây ra bởi virus gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV). Virus này có hai type chính là HIV-1 và HIV-2, trong đó nhóm 1 xuất hiện phổ biến và là nguyên nhân chính gây ra AIDS. Cho đến nay, dù đã có những chương trình hành động toàn cầu cùng với sự phát triển của các phương pháp điều trị, AIDS vẫn là đại dịch của toàn nhân loại. Theo chương trình HIV/AIDS của Liên hiệp quốc (UNAIDS, 2017), tính đến tháng 6 năm 2017, thế giới có khoảng 36,7 triệu người đang mang căn bệnh HIV/AIDS, trong đó số đối tượng nhiễm mới là 1,8 triệu người và có khoảng 1 triệu bệnh nhân đã chết vì AIDS trong năm 2016. Ở Việt Nam, theo số liệu mới nhất của Cục phòng chống HIV/AIDS, Bộ Y tế (Báo cáo số 958/BC-BYT của Cục phòng chống HIV/AIDS, ngày 31/8/2017) trong 6 tháng đầu năm 2017, số người x t nghiệm phát hiện mới nhiễm HIV 4.541 người, số người nhiễm HIV chuyển sang giai đoạn AIDS là 2.321 người, số người nhiễm HIV t vong là 799. Số người nhiễm HIV lũy tiến đang c n sống là 209.591 người, số bệnh nhân AIDS là 90.190 và số t vong là 90.980 người. HIV-1 có hệ gen nằm trong phần lõi của virus và bao gồm hai sợi RNA (+) đơn, mỗi sợi có chiều dài khoảng 9,8 kb và có 9 gen mã hóa cho 15 protein khác nhau. Trên mỗi sợi RNA có 3 gen cấu trúc là gag, pol và env; trong đó gag có nghĩa “group-antigen” (kháng nguyên nhóm), pol là “polymerase” và env là “envelope” vỏ. Các gen gag và env mã hóa cho nucleocapsid và glycoprotein của màng virus; gen pol mã hóa cho 3 enzyme là reverse transcriptase, integrase và protease. Ngoài ra, HIV-1 còn có 6 gen (vif, vpu, vpr, tat, rev và nef) ở vùng RNA 9 kb (Hoffmann và tập thể, 2007). Protease của HIV-1 là enzyme không thể thiếu trong chu trình sống của virus. Nó cắt các chuỗi polypeptide gag, gag-pol tại những vị trí nhất định để tạo thành các protein cấu trúc và enzyme cần thiết cho virus hoàn chỉnh. Các đột biến điểm làm bất hoạt protease dẫn đến tạo ra các dòng virus HIV-1 không hoàn chỉnh không có khả năng nhiễm vào tế bào chủ. Vì có vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của HIV-1 nên protease được xem như một trong các đích quan trọng nhất cho liệu pháp điều chế thuốc ức chế protease chống HIV- 1. Thuốc ức chế protease sẽ làm giảm hàm lượng HIV-1 trong máu, tăng số lượng tế bào lympho T CD4 và mang lại nhiều cơ hội sống sót hơn cho bệnh nhân HIV-1. Tuy vậy, tỷ lệ đột biến axit amin của protease và khả năng tạo các chủng mới của HIV-1 là rất cao dẫn đến tình trạng kháng thuốc ức chế protease của HIV-1. Ở mức độ In vitro, những đột biến axit amin này không ảnh hưởng quan trọng đến các chất ức chế protease nhưng trong liệu pháp điều trị, các đột biến này lại ảnh hưởng từ 50-90% đến sự tăng hàm lượng thuốc ức chế 1
protease (Bossi và tập thể, 1999). Vì vậy, cần thiết phải nghiên cứu các chất ức chế protease của HIV-1 để có thuốc mới điều trị thích hợp cho bệnh nhân. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu một số chất nguồn gốc thực vật ức chế protease của HIV-TYPE 1” nhằm tách chiết, tinh sạch, xác định cấu trúc và tính chất của một số hợp chất thực vật có khả năng ức chế protease HIV -1, đóng góp cơ sở cho việc điều chế các thuốc mới trong điều trị HIV/AIDS. 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài - Điều tra được sự có mặt của các chất ức chế protease HIV-1 từ nguồn thực vật Việt Nam thông qua pepsin, một protease aspartyl mang những đặc điểm tương đồng trong cấu trúc cũng như cơ chế xúc tác với protease HIV-1. - Thu nhận và tinh sạch được một số chất ức chế protease HIV-1 từ nguồn thực vật. - Xác định được cấu trúc, tính chất và đánh giá được cơ chế tác dụng của một số chất ức chế protease HIV-1 đã thu nhận được. 3. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài Đối tượng nghiên cứu của đề tài: Chất ức chế protease HIV-1 từ nguồn thực vật. Nội dung nghiên cứu chính của luận án: - Sàng lọc các thực vật có tác dụng ức chế enzyme tương tự protease HIV– 1 (pepsin). - Tinh sạch một số chất ức chế protease HIV-1 từ thực vật được sàng lọc. - Nghiên cứu một số tính chất của các chất ức chế protease HIV-1 đã thu nhận được. 4. Địa điểm thực hiện đề tài Các nghiên cứu của luận án được thực hiện chủ yếu tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Phần tinh sạch chất ức chế protease HIV-1 từ thực vật được thực hiện với sự hỗ trợ, hợp tác của Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu Trung ương. Phần đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân được thực hiện tại Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phần giải phổ và kiểm tra độc lập kết quả phổ tại Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. 5. Đóng góp mới của đề tài - Đã sàng lọc được 156 dịch chiết thực vật khác nhau về khả năng ức chế enzyme tương tự protease HIV-1 (pepsin) bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch có chứa cơ chất hemoglobin. 2
- Đã tinh sạch được 7 chất ức chế protease HIV-1 từ thực vật, bao gồm: axit maslinic từ cây Gối hạc, axit 24-hydroxyusolic từ lá Hồng, 21β-O-[(2E)- 6-hydroxyl-2,6-dimethyl-2,7-octadienoyl] pitheduloside G, iricariside E5, ginsenoside Rg1, axit rotungenic và pitheduloside G từ cây Rau gai thối. Trong đó, lần đầu tiên phát hiện và tinh sạch được axit maslinic có hoạt tính ức chế protease HIV-1 từ cây Gối hạc, lần đầu tiên phát hiện, tinh sạch, nghiên cứu cấu trúc, định danh một hợp chất saponin mới 21β-O-[(2E)-6- hydroxyl-2,6-dimethyl-2,7-octadienoyl] pitheduloside G từ cây Rau gai thối. Đồng thời lần đầu tiên phát hiện hoạt tính ức chế protease HIV-1 của các hợp chất 24-hydroxyursolic, iricariside E5, ginsenoside Rg1, axit rotungenic và pitheduloside G. 6. Ứng dụng thực tiễn của đề tài - Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở xây dựng quy trình sàng lọc phân lập, tách chiết và nghiên cứu tính chất các chất ức chế protease HIV-1 có nguồn gốc thực vật. - Thành công của đề tài sẽ là tiền đề cho việc phát triển các thuốc ức chế protease HIV-1. 7. Bố cục của luận án Luận án gồm 112 trang bao gồm: Phần mở đầu (4 trang); Tổng quan tài liệu (31 trang); Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (11 trang); Kết quả và thảo luận (47 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang), Các công trình khoa học của tác giả liên quan đến luận án (1 trang), Tài liệu tham khảo (14 trang), với 147 tài liệu gồm 2 thứ tiếng tiếng Việt (18 tài liệu) và tiếng Anh (129 tài liệu). Luận án có 3 bảng, 20 hình. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về virus gây suy giảm miễn dịch của ngƣời type 1 (HIV-1) và protease của HIV- 1 Virus suy giảm miễn dịch ở người (Human immunodeficiency virus - HIV) là nguyên nhân chính gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (Acquired Immunodeficiency Syndrome - AIDS) và là một trong những virus gây bệnh nguy hiểm nhất hiện nay. Theo các tài liệu đã công bố, có ít nhất hai type HIV là HIV type 1 (HIV-1) và HIV type 2 (HIV-2), nhưng HIV-1 là nguyên nhân chính gây ra AIDS trên toàn thế giới và là một trong số những virus gây bệnh nghiêm trọng nhất hiện nay. HIV thuộc họ retrovirus, là họ gây ung thư cho người và động vật. HIV-1 có 3 nhóm chính là M (main), N (new), và O (outlier) (Plantier và tập thể, 2009). Có tới 90% sự lây nhiễm HIV trên toàn thế giới thuộc nhóm M; nhóm này có 9 phân type được ký hiệu bằng các chữ cái A-D, F-H, J, K và nhiều dạng tái tổ hợp khác được gọi tắt là các phân nhóm CRF (circulating recombinant forms) (Liu và tập thể, 2017). Ở Việt Nam và các nước Đông Nam Á phân 3
nhóm HIV-1 phân lập từ các bệnh nhân nhiễm HIV-1 chủ yếu thuộc nhóm CRF01_AE, bên cạnh đó c n có một số ít các phân nhóm B, C và các dạng tái tổ hợp khác (UNAIDS, 2010; Nguyen và tập thể, 2003; Ishizaki và tập thể, 2009; Phan và tập thể, 2010). Protease của HIV type 1 (protease HIV-1) được mã hóa bởi hệ gen của HIV-1 là một aspartic protease, họ retropepsin A2, được tạo ra trong quá trình HIV nhiễm vào tế bào chủ, có chức năng thủy phân các polypeptide gag, gag-pol và env của virus HIV thành các protein trưởng thành có hoạt tính cần thiết cho chu trình sống của virus. Cụ thể là HIV-1 protease nhận biết 9 trình tự peptide khác nhau trên polypeptide gag để tạo ra các protein cấu trúc: matrix, capsid, nucleocapsid và P6 của HIV; thủy phân polypeptide gag-pol tạo thành 3 enzyme: protease, reverse transcriptase và intergrase cần thiết cho quá trình sao chép của HIV và thủy phân polypeptide env thành các protein vỏ gp120 và gp41 của HIV (Darke và tập thể, 1989). Protease HIV-1 không phân cắt các protein thông thường nên việc xác định hoạt độ của enzyme phải dựa trên các cơ chất tổng hợp đặc hiệu được thiết kế với trình tự cắt giống trình tự trên protein gag và gag-pol. Phương pháp đo hoạt độ protease HIV-1 tùy thuộc vào đặc trưng của cơ chất s dụng. 1.2. Các chất ức chế protease HIV và ứng dụng trong điều trị AIDS Các thuốc tổng hợp hóa học ức chế protease HIV-1 dùng cho điều trị bệnh nhân HIV/AIDS đã được phát triển và s dụng rộng rãi trong điều trị HIV/AIDS. Hiện nay liệu pháp điều trị kháng retrovirus (ART) hay liệu pháp điều trị kháng retrovirus hiệu lực cao (HAART) được xem là hiệu quả nhất trong kiểm soát sự phát triển của HIV/AIDS (Hoffmann và tập thể, 2007). ART và HAART đều dựa chủ yếu vào sự phối hợp 3 chất ức chế enzyme, đó là chất ức chế của enzyme reverse transcriptase, integrase và protease của HIV. Tuy nhiên, việc s dụng các chất ức chế enzyme trong đó có các chất ức chế protease HIV có nhược điểm là dễ gây ra các tác dụng phụ cho người bệnh khi s dụng trong thời gian dài (Hofmann et al., 2007). Chính vì vậy, bên cạnh các thuốc tổng hợp hóa học, các nhà khoa học trên thế giới cũng không ngừng tìm kiếm và chọn lọc các chất tự nhiên từ dịch chiết thực vật có tác dụng ức chế protease HIV-1 ((Singh và tập thể, 2005; Cheenpracha và tập thể, 2006; Magadula và tập thể, 2010; Hattori và tập thể, 2013; Han và tập thể, 2014). Việc tìm ra và tinh chế được các hợp chất tinh khiết có hoạt tính ức chế protease HIV-1 cũng sẽ là cơ sở để thiết kế các chất hóa học có cấu trúc tương tự nhưng được cải biến phù hợp nhằm tăng hiệu quả ức chế protease HIV-1. 4
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng và nguyên liệu 2.1.1. Đối tượng Các mẫu thực vật s dụng trong nghiên cứu được cung cấp từ hai nguồn. Các mẫu thực vật là do Viện Dược liệu Trung ương cung cấp. Các mẫu thực vật khác là do nhóm nghiên cứu tại Đại học Khoa học Tự nhiên thu ở các địa phương khác nhau như H a Bình, Sơn La, Hải Dương, Bắc Giang... Các mẫu này được định danh bởi TS. Đỗ Thị Xuyến – Bộ môn Thực vật học - hoa Sinh học, Trường Đại học hoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Mẫu nghiên cứu hiện được lưu giữ tại hoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu và Trường Đại học hoa học Tự nhiên. 2.1.2. Nguyên liệu Các hóa chất chính s dụng cho nghiên cứu bao gồm: protease HIV-1 tái tổ hợp của Sigma-Aldrich (Mỹ) và protease HIV-1 tái tổ hợp là sản phẩm của đề tài mã số: ĐT-PTNTĐ.2012-G/02 và đã được công bố bởi Nguyen và tập thể (2015), pepsin, hemoglobin, pepstatin A, dimethyl sulphoxide (DMSO), Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB), cơ chất peptide L6525 (Lys-Ala-Arg- Val-Nle-p-nitro-Phe-Glu-Ala-amide) đặc hiệu cho protease HIV-1 của Sigma- Aldrich (Mỹ), kit xác định hoạt tính protease HIV-1 s dụng cơ chất huỳnh quang Kit SensoLyte® 520 HIV-1 Protease Assay (Anaspec, Mỹ). Các hóa chất khác như axit trichloroacetic (TCA), agar, urea, β- mercaptoethanol… đều đạt độ tinh sạch dành cho phân tích. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phân tách các hợp chất từ dịch chiết thực vật bằng tách phân đoạn bằng dung môi hữu cơ (ethanol, n-hexane, ethyl axetate, n-butanol và sắc ký qua cột silica gel 2.3.2. Xác định cấu trúc của chất được phân tách bằng phân tích phổ t ngoại, phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối lượng 2.3.3. Xác định hoạt tính ức chế pepsin bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch có chứa cơ chất hemoglobin 2.3.4. Xác định hoạt tính ức chế pepsin theo phương pháp Anson cải tiến s dụng quy trình mô tả của hãng Sigma Aldrich 2.3.5. Xác định hoạt tính protease HIV-1 s dụng cơ chất peptide đặc hiệu theo Richards và tập thể (1990) 2.3.6. Xác định hoạt độ của protease HIV-1 bằng cơ chất huỳnh quang trên máy quang phổ kế huỳnh quang 2.3.7. Xác định các kiểu ức chế của các chất ức chế protease HIV-1 thông qua đánh giá hằng số động học Km và Vmax 2.3.8. Th độc của các chất trên d ng tế bào HEK nuôi cấy 5
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Sàng lọc các cây thuốc có tác dụng ức chế enzyme tƣơng tự protease của HIV – 1 3.1.1. Thiết lập phƣơng pháp thử tác dụng ức chế của các mẫu nghiên cứu lên hoạt độ của pepsin-enzyme tƣơng tự protease HIV-1 Do protease HIV-1 có tính đặc hiệu cơ chất cao, các chất có mặt trong dịch chiết có thể ảnh hưởng đến phép phân tích bằng quang phổ kế nên gần như không thể s dụng enzyme này trong các bước sàng lọc sơ bộ chất ức chế từ thực vật. Một trong các giải pháp thay thế là s dụng enzyme pepsin vì pepsin cùng thuộc họ protease aspartyl và mang những đặc điểm tương đồng về cấu trúc cũng như cơ chế xúc tác với protease HIV-1. Chính vì vậy, trong nhiều nghiên cứu, pepsin thường được dùng như enzyme đích để bước đầu sàng lọc các chất ức chế của protease HIV-1 từ thực vật (Hinay và Sarol, 2014; Rege tập thể, 2014; Singh và tập thể, 2013). Trong nghiên cứu này, pepsin cũng được dùng thay cho protease HIV-1 để th nhanh tác dụng ức chế của các dịch chiết thực vật bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch có chứa cơ chất hemoglobin. Chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm để thiết lập phương pháp sàng lọc nhanh dịch chiết thực vật nhằm xác định điều kiện pH, nồng độ hòa tan và thời gian phân giải thích hợp cho pepsin và hemoglobin. Chúng tôi thấy để thu được vòng phân giải cơ chất trên đĩa thạch có đường kính phù hợp (1,1-1,2 cm) thì nồng độ pepsin cần có là 1 mg/ml, s dụng 10 l/giếng mẫu, thời gian ủ là 120 phút, trong điều kiện môi trường thạch có pH 3,6. Mặc dù pH 3,6 không phải pH tối ưu cho pepsin hoạt động (pH tối ưu của pepsin là 2), nhưng pH này được lựa chọn để đảm bảo pepsin vẫn hoạt động tương đối tốt và đây cũng là giá trị pH tương đối gần với pH của protease HIV-1 (pH= 4,6). 3.1.2. Thu nhận ịch chiết thực vật v chất tinh sẵn có Các mẫu thực vật được lựa chọn điều tra trong nghiên cứu này bao gồm 3 nhóm. Nhóm i; bao gồm các loài thực vật đã được công bố có khả năng ức chế HIV-1 Otake và tập thể (1995); Lã Đình Mỡi và tập thể (2007); Đỗ Thế Lộc và tập thể (2012); Trần Thị Chung Chiến và tập thể (2012), Hattori và tập thể (2013). Nhóm ii: bao gồm các loài thực vật là cây thuốc quý có tính đặc hữu ở Việt Nam đã công bố có nhiều tác dụng sinh học như chống viêm, chống ung thư v.v.. trong các công bố của Đỗ Tất Lợi (2001); Đỗ Huy Bích và tập thể (2006); Viện Dược liệu (2004); Ngô Vân Thu và tập thể (2011); Võ Văn Chi và tập thể (2012). Nhóm iii: bao gồm một số loài thực vật được chọn ngẫu nhiên. Sau khi thu mẫu, các mẫu thực vật đã được định danh, thu nhận các dịch chiết đồng thời trong ethanol và trong nước cất bằng phương pháp ngâm chiết trong dung môi và cất quay chân không. Danh sách sàng lọc bao gồm 156 mẫu thực vật thuộc 92 loài khác 6
nhau (có một số mẫu là cùng một loài nhưng khác nhau về bộ phân được s dụng) được dùng để nghiên cứu sàng lọc khả năng ức chế enzyme tương tự protease HIV-1 (pepsin). 3.1.3. Sàng lọc các dịch chiết thực vật có tác dụng ức pepsin Kết quả điều tra khả năng ức chế pepsin của 156 loại dịch chiết thực vật được thể hiện qua việc so sánh bán kính đường phân giải cơ chất hemoglobin trên các đĩa thạch so giữa mẫu không bổ sung dịch chiết và mẫu có chứa dich chiết. Kết quả cho thấy trong số 156 dịch chiết được điều tra, thì 48 mẫu dịch chiết thể hiện có tác dụng ức chế pepsin (chiếm khoảng 31%), trong số đó 7 mẫu có tác dụng mạnh nhất, đó là Gối hạc (lá), Ổi (lá), hồng (lá), Thạch Châu (lá), Ma Hoàng (cả cây) và Rau gai thối (thân). 3.2. Tinh sạch chất ức chế protease HIV-1 từ thực vật đƣợc sàng lọc Chúng tôi đã chọn 03 mẫu thực vật có dịch chiết thể hiện khả năng ức chế mạnh pepsin trong 156 mẫu khảo sát để nghiên cứu thu nhận chất ức chế protease HIV-1, đó là: Gối hạc, Hồng và Rau gai thối. 3.2.1. Tách phân đoạn và tinh sạch chất ức chế protease HIV-1 từ lá Gối hạc Quy trình chiết xuất và phân đoạn các chất từ lá cây Gối hạc được chiết với ethanol để thu cao tổng số, sau đó được chiết tiếp trong các dung môi có độ phân cực tăng dần để thu riêng các phân đoạn: n-hexane (Hx), etyl acetate (EtOAc), và butanol (BuOH). hi th tác dụng ức chế lên pepsin, cao phân đoạn Hx có hoạt tính ức chế pepsin cao nhất (Hình 3.2, giếng 7) đã được lựa chọn. Cao phân đoạn Hx được chạy qua sắc ký silica gel, r a giải thu được 6 phân đoạn (1-6), trong đó phân đoạn 5 (PĐ5) có hoạt tính ức chế pepsin cao nhất (Hình 3.3, giếng 6). Hình 3.1. Khả năng ức chế pepsin của các phân đoạn dung môi lá cây Gối hạc Giếng 1: HCl 0,01 N, giếng 2: DMSO, giếng 3: pepsin, giếng 4: pepsin + DMSO, giếng 5: pepsin + pepstatin A, giếng 6: cao cồn, giếng 7 - 10: các phân đoạn cao Hx, EtOAc, BuOH và cao nước. Hình 3.2. Khả năng ức chế pepsin của các phân đoạn tách từ cao Hx của cây Gối hạc Giếng 1: HCl 0,01 N, giếng 2: DMSO, giếng 3: pepsin, giếng 4: pepsin + DMSO, giếng 5: pepsin + pepstatin A, giếng 6: phân đoạn cao Hx, giếng 7-12: phân đoạn PĐ 1 – 6. Phân đoạn PĐ5 tiếp tục được phân tách bằng cột silica gel với hệ dung môi r a giải n-hexane/ethyl acetate (2/1; 1/1; 1/2) thu được hợp chất GH. 7
ết quả khảo sát GH bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (silica gel pha thường, hệ dung môi n-hexane/ethyl acetate; 1/2) cho thấy, phân đoạn này có một vết chính (Rf=0,5, màu vàng, quan sát UV-365 nm sau khi phun thuốc th H2SO4 10%/ethanol, sấy bản mỏng ở 110oC trong 5 phút). ết quả th khả năng ức chế của GH cho thấy: GH có hoạt tính ức chế pepsin rõ rệt ở các nồng độ từ 5-50 mg/ml (Hình 3.3B). A B Hình 3.3. A) Sắc ký đồ SKLM hợp chất GH và Khả năng ức chế pepsin các phân đoạn tách từ dịch chiết lá cây Gối hạc (B) Giếng 1: HCl 0,01 N, giếng 2: DMSO, giếng 3: pepsin, giếng 4: pepsin + DMSO, giếng 5: pepsin + pepstatin A, giếng 6: cao cồn, giếng 7: phân đoạn cao Hx, giếng 8: phân đoạn PĐ5 và giếng 9-12: GH với các nồng độ từ 5 - 10 - 25 - 50 mg/ml. Sắc kí bản mỏng Hình 3.3A cho một băng duy nhất chứng tỏ hợp chất GH đã tinh sạch và kết quả kiểm tra cho thấy khả năng ức chế tốt pepsin trên đĩa thạch Hình 3.3B thể hiện ở các giếng 9-12. Như vậy chúng tôi đã tách được, hợp chất GH để s dụng cho nghiên cứu tiếp theo. Kết quả phân tích khả năng ức chế protease HIV-1 của GH (Hình 3.4) cho thấy hợp chất này ức chế protease HIV-1, ở nồng độ 6,5 µg/ml GH ức chế 50% hoạt độ của protease HIV-1, GH ở nồng độ 9,5 µg/ml có thể ức chế tới 90% hoạt độ của protease HIV-1. Như vậy GH là một chất ức chế protease aspartyl là pepsin và protease HIV-1. Hình 3.4. Khả năng ức chế protease HIV-1 của GH Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu các tính chất vật lý, các dữ kiện phổ của chất GH. ết quả phân tích cho thấy hợp chất GH là một loại bột vô định hình màu trắng, nhiệt độ nóng chảy: 246-248oC. Phổ UV (MeOH) λmax :201 nm. Phổ IR (cm-1): 3402; 2924; 1659; 1614; 1183; 1093. Phổ ESI-MS (m/z) =495 [M+Na]+. Phổ 1H-NMR (CD3OD+CDCl3; 500 MHz): 5,28 (1H, br s, 8
H-12), 3,64 (1H, m, H-2), 2,95 (1H, d, J=9,5 Hz, H-3), 2,83 (1H, m, H-18), 1,15; 1,02; 0,99; 0,94; 0,91; 0,81; 0,80 (tín hiệu 3H, s, H-27; 23; 25; 30; 29; 24; 26). Phổ 13C-NMR (CD3OD+CDCl3; 125 MHz): 46,1 (C-1), 68,2 (C-2), 83,1 (C-3), 38,9 (C-4), 55,0 (C-5), 18,0 (C-6), 33,6 (C-7), 39,0 (C-8), 47,4 (C-9), 37,9 (C-10), 22,7 (C-11), 121,8 (C-12), 143,7 (C-13), 41,5 (C-14), 27,3 (C-15), 22,7 (C-16), 46,0 (C-17), 41,0 (C-18), 45,7 (C-19), 30,3 (C-20), 33,4 (C-21), 32,3 (C-22), 28,2 (C-23), 16,5 (C-24), 16,1 (C-25), 16,3 (C-26), 25,5 (C-27), 180,5 (C-28), 32,7 (C-29), 23,2 (C-30). Phổ IR cho biết trong phân t chất GH có các nhóm chức sau: nhóm OH (dải hấp thụ có đỉnh 3402 cm-1); nhóm C=O (đỉnh 1659 cm-1); liên kết đôi C=C (đỉnh 1614 cm-1); liên kết C-O (đỉnh 1183, 1093 cm-1). Phổ 1H-NMR cho biết có một proton olefin có độ chuyển dịch là 5,28 ppm. Ngoài ra còn có 7 tín hiệu proton của của nhóm methyl xuất hiện ở dạng pic đơn ở độ chuyển dịch từ 0,80 ppm đến 1,15ppm. Phổ 13C-NMR của chất số 1 cho biết có tổng cộng 30 tín hiệu cacbon. Có một tín hiệu cacbon C=O tại δc=180,5 ppm. Ngoài ra c n có 2 tín hiệu cacbon có độ chuyển dịch thuộc vùng liên kết đôi lần lượt ở δc=121,8 ppm và δc=143,7 ppm. Dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13C-NMR khẳng định có một liên kết đôi trong phân t chất GH. Với số lượng 30 cacbon, có 7 tín hiệu singlet của proton nhóm CH3 nhận định hợp chất GH là một triterpenoid thuộc khung olean (Dam và tập thể, 2010). Tiếp tục với việc có một liên kết đôi, có nhóm C=O trong phân t , hai cacbon bậc ba sp3 liên kết với oxy, cùng với các tính chất vật lý như bột màu trắng, nhiệt độ nóng chảy khoảng 246-248oC cho thấy đây có thể là axit maslinic, một chất có khối lượng phân t 472, phù hợp với dữ kiện phổ khối. So sánh với các dữ liệu phổ đã công bố trước đây (Dam và tập thể, 2010; Pal và tập thể, 2013), có thể khẳng định hợp chất GH là axit maslinic (Hình 3.5). Hình 3.5. Công thức cấu tạo axit maslinic 3.2.2.Tách phân đoạn và tinh sạch hợp chất ức chế protease HIV-1 từ lá cây Hồng Các phân tích cho thấy lá cây Hồng có chứa nhiều tannin, các axit triterpen chẳng hạn như: α-amyrin, uvaol, axit ursolic, axit 19α- 9
hydroxyursolic và axit 19α, 24-dihydroxyursolic (Phương Thiện Thương và tập thể, 2008) . Quy trình chiết xuất và phân đoạn các chất từ lá hồng 2 kg (độ ẩm 8,5 %) được cắt nhỏ, ngâm chiết với ethanol 96% ở nhiệt độ phòng (chiết 3 lần, mỗi lần 4 ngày). Dịch chiết được gộp lại và cất loại cồn nước dưới áp suất giảm thu được cắn chiết cồn đã cô khô (98,5 g). Sau đó, cắn chiết được h a tan vào nước cất (0,5 lít) thành hỗn dịch rồi lắc, chiết phân đoạn lần lượt với n-hexan (0,5 lít × 3 lần), dicloromethan (0,5 lít × 3 lần), n-butanol (0,5 lít × 3 lần). Các dịch chiết n-hexan, dicloromethan và n-butanol được tách riêng, cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các phần cắn tương ứng: cắn phân đoạn n-hexan (31,2 g), cắn phân đoạn dicloromethan (10,8 g) và cắn phân đoạn n-butanol (24,7 g). Tiếp theo đó, cắn phân đoạn dicloromethan (10,8 g) được chạy qua cột sắc ký silica gel, r a giải bằng hệ dung môi n-hexan/ethyl acetat với tỷ lệ ethyl acetat tăng dần từ 0 đến 100 %. Kiểm tra thành phần dịch r a giải bằng sắc ký lớp mỏng. Dịch r a giải được chia thành 4 phân đoạn chính: PĐ1 (0,8 g); PĐ2 (3,7g); PĐ3 (1,1g); PĐ4 (0,9 g), Phân đoạn PĐ3 (1,1 g) tiếp tục được phân tách bằng cột silica gel với hệ dung môi r a giải n- hexan/ethyl acetat (1/1; 1/2) thu được chất số 1 (151 mg). ết quả kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất LH bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng, quan sát ở đèn t ngoại UV 365 nm sau khi phun thuốc th H2SO4 10%/ethanol, sấy bản mỏng ở 110oC trong 5 phút. Sắc ký đồ được thể hiện ở Hình 3.6. Hình 3.6. Sắc ký đồ SKLM của hợp chất LH 1: Dịch chiết dicloromethan lá Hồng 2: Hợp chất LH Hệ dung môi: n-hexane/ethyl acetate (1:1). Như vậy, sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng cho thấy cả hợp chất LH cho duy nhất một vết đậm, rõ n t. Vì vậy, có thể sơ bộ kết luận hợp chất LH phân lập được từ lá Hồng đã được tinh sạch. 10
Hình 3.7. A) Khả năng ức chế pepsin của các phân đoạn tinh sạch từ dịch chiết lá cây Hồng. B) Hoạt tính còn lại của protease HIV-1 khi có mặt của LH trong phản ứng. Giếng 1: HCl 0,01 N, giếng 2: DMSO, giếng 3: pepsin, giếng 4: pepsin + DMSO, giếng 5: pepsin + pepstatin A, giếng 6 - 9: pepsin + chất đối chứng từ lá Hồng, và giếng 11- 14: pepsin + LH với các nồng độ từ 50 - 25 - 10 - 5 mg/ml. ết quả phân tích khả năng ức chế pepsin và protease HIV-1 cho thấy LH thể hiện hoạt tính ức chế pepsin rõ rệt ở các nồng độ từ 5-50 mg/ml (Hình 3.7 A) và ức chế 50% hoạt tính protease HIV-1 tại nồng độ 3,2 µg/ml (Hình 3.7B). Như vậy, hợp chất LH là một chất ức chế protease aspartyl là pepsin và protease HIV-1. ết quả phân tích các tính chất vật lý của hợp chất LH cho thấy hợp chất này tồn tại ở dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ UV (MeOH) λmax: 201 nm. IR νmax (cm-1): 3430; 2925; 1694, 1461, 1016. Phổ ESI-MS (m/z) =495 [M+Na]+. Phổ 1H-NMR (C5D5N; 500 MHz): 5,46 (1H, br s, H-12), 4.46 (1H, d, J=11,0 Hz, H-3), 3,63 (2H, d, m, H-24), 2,60 (1H, d, J=6,0 Hz, H-18), 1,53 (3H, s, H-23), 1,20 (3H, s, H-27), 0,99 (3H, s, H-25), 0,97 (3H, d, J=6,0 Hz, H-30), 0,93 (3H, d, J=6,0 Hz, H-29), 0,84 (3H, s, H-26). Phổ 13C-NMR (C5D5N; 125 MHz): 38,1 (C-1), 28,6 (C-2), 80,1 (C- 3), 39,9 (C-4), 56,4 (C-5), 19,0 (C-6), 33,8 (C-7), 48,0 (C-8), 48,1 (C-9), 37,0 (C-10), 24,9 (C-11), 125,5 (C-12), 139,2 (C-13), 42,4 (C-14), 28,4 (C- 16), 43,1 (C-17), 53,5 (C-18), 39,4 (C-19), 39,5 (C-20), 31,1 (C-21), 37,4 (C-22), 23,8 (C-23), 64,5 (C-24), 17,3 (C-25), 16,1 (C-26), 23,6 (C-27), 179,9 (C-28), 17,5 (C-29), 21,4 (C-30) Phổ IR cho biết trong phân t chất số LH có các nhóm chức sau: nhóm OH (dải hấp thụ có đỉnh 3430 cm-1); nhóm C=O (đỉnh 1694 cm-1), liên kết C-O (đỉnh 1016 cm-1) Phổ 1H-NMR cho biết có một proton olefin có độ chuyển dịch là 5,46 ppm. Ngoài ra còn có 6 tín hiệu proton của của nhóm methyl trong đó có 4 tín hiệu xuất hiện ở dạng pic đơn và 2 tín hiệu xuất hiện dưới dạng pic kép với hằng số ghép cặp J= 6,0 Hz ở độ chuyển dịch từ 0,84 ppm đến 1,53 ppm. Phổ 13C-NMR của chất số LH cho biết có tổng cộng 30 tín hiệu cacbon. Có một tín hiệu cacbon C=O tại δc=179,9 ppm. Ngoài ra c n có 2 tín hiệu cacbon có độ chuyển dịch thuộc vùng liên kết đôi lần lượt ở δc=125,4 ppm và δc=139,2 ppm, một tín hiệu của nhóm CH2 liên kết với oxy ở δc=80,1 ppm. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR khẳng định có một liên kết đôi trong phân t chất số LH. Phổ ESI-MS có đỉnh ion tại m/z: 495 [M+Na]+ (positive) cho biết công thức phân t của LH là C30H48O4 (M=472). Với số lượng 30 cacbon kết hợp với các tín hiệu độ chuyển dịch của 2 cacbon nối đôi nhận định chất số LH là một triterpen khung ursan ( Dam và tập thể, 2010, Phuong và tập thể, 2008). Tiếp tục, với việc có một 11
liên kết C=O, một cacbon bậc ba liên kết với oxy ở δc=80,1 ppm, 6 nhóm CH3, một nhóm oxy methylen, kết hợp với khối lượng phân t khẳng định chất số LH có cấu trúc tương tự với axit ursolic, chỉ khác rằng một nhóm methyl của axit ursolic đã bị thay thế bởi nhóm CH2-OH. So sánh với các dữ liệu phổ đã công bố trước đây (Ahmad và Atta, 1994, Phuong và tập thể, 2008) khẳng định chất số LH là axit 24-hydroxyursolic (Hình 3.8). Hình 3.8. Công thức cấu tạo của axit 24-hydroxyursolic Axit 24-hydroxyursolic (3β,24-dihydroxy-urs-12-en-28-oic acid) là một triterpenoid có 5 vòng 6 cạnh có công thức phân t C30H49O4, gần giống cấu trúc của axit ursolic. Theo nghiên cứu trước đây, axit ursolic (hợp chất tương tự axit 24-hydroxyursolic) được biết đến là ức chế protease HIV-1 (Nguyễn Hồng Anh và tập thể, 2015). Cho đến nay, axit 24- hydroxyursolic đã được phân lập từ một số loài thực vật như: lá cây Hồng (Diospyros kaki L.) (Thuong tập thể, 2008; Khanal tập thể, 2010), và từ lá cây Bọ mẩy (Clerodendrum cyrtophyllium T.) (Trần Thị Thanh Huyền và tập thể, 2012). Ngoài các nghiên cứu về phân tách và tinh sạch axit 24- hydroxyursolic, chỉ có một số ít các nghiên cứu được thực hiện để đánh giá hoạt tính sinh học của hợp chất này. Theo Khanal và tập thể (2010), axit 24- hydroxyursolic được chiết xuất từ lá cây Hồng (Diospyros kaki L.) có tác dụng ức chế sự tăng sinh tế bào, gây kích hoạt mạnh các protein kinase được hoạt hoá bởi AMP (AMPK) và có những tác động trung gian quan trọng trong chống ung thư bằng cách ức chế cyclooxygenase (COX-2) biểu hiện trong tế bào HT-29. Ngoài ra, axit 24-hydroxyursolic còn gây ra quá trình chết theo chương trình và phân mảnh DNA ở các tế bào HT-29 cũng như ức chế hoạt tính của AP-1 và quá trình chuyển dạng ở các tế bào JB6 CL41. Đến nay chưa có công bố nào về tác dụng ức chế protease HIV-1 của axit 24-hydroxyursolic. 3.2.3. Tách phân đoạn và tinh sạch các chất ức chế protease HIV-1 từ cây Rau gai thối Thân cây Rau gai thối đã phơi khô (7,0 kg) được cắt nhỏ, ngâm chiết với ethanol 96% ở nhiệt độ phòng (chiết 3 lần, mỗi lần 4 ngày). Dịch chiết được gộp lại và cất loại cồn nước dưới áp suất giảm thu được cắn chiết cồn đã cô khô (155.5 g). Cắn chiết được hòa tan vào nước cất (1,0 lít) thành hỗn dịch rồi lắc, chiết phân đoạn lần lượt với n-hexane (1,0 lít × 3 lần), ethyl acetate (1,0 lít × 3 lần), n-butanol (1,0 lít × 3 lần). Các dịch chiết n-hexane, ethyl acetate và n-butanol được tách riêng, cất loại dung môi dưới áp suất giảm 12
thu được các phần cắn tương ứng: cắn phân đoạn n-hexane (54 g), cắn phân đoạn ethyl acetate (EtOAc; 95 g) và cắn phân đoạn n-butanol (31.3 g). Cắn phân đoạn EtOAc (95 g) được đưa lên cột sắc ký silica gel pha thường, r a giải bằng hệ dung môi CH2Cl2-MeOH với tỷ lệ methanol tăng dần từ 0 đến 100% thu được 5 phân đoạn (PĐ1-PĐ5). Phân đoạn PĐ3 tiếp tục được phân tách bằng cột silica gel pha thường với hệ dung môi r a giải CH2Cl2-MeOH (15/1; 10/1; 8/1) thu được 5 phân đoạn (PĐ3.1 đến PĐ3.5). Phân đoạn PĐ3.2 được đưa lên cột silica gel pha đảo RP-18 r a giải gradient với hệ dung môi MeOH/H2O (1/1; 2/1; 3/1) thu được chất số 1 (14 mg). Phân đoạn PĐ3.4 được phân tách trên cột silica gel pha đảo RP-18 r a giải với hệ dung môi MeOH/H2O (1/2; 1/1; 2/1) thu được 4 phân đoạn (PĐ3.4.1 đến PĐ3.4.4). PĐ3.4.3 được tinh chế trên cột silica gel pha đảo RP-18 r a giải đẳng dòng với hệ dung môi MeOH/H2O (3/2) thu được chất số 3 (22 mg). Phân đoạn PĐ3.4.1 được tinh chế trên cột silica gel pha đảo RP-18 r a giải với hệ dung môi MeOH/H2O (1/1) thu được chất số 4 (9 mg). Phân đoạn PĐ2 được đưa lên cột silica gel pha thường, r a giải gradient bằng hệ dung môi n-hexan-EtOAc với các tỷ lệ 1/1; 2/1; 3/1 thu được 4 phân đoạn (PĐ2.1 đến PĐ2.4). Chất số 2 (12 mg) được phân lập từ phân đoạn PĐ2.3 trên cột silica gel pha đảo RP-18 r a giải với hệ dung môi MeOH/H2O (2/1; 3/1). Phân đoạn PĐ3.5 được đưa lên cột silica gel pha đảo RP-18 r a giải gradient với hệ dung môi MeOH/H2O (1/1; 2/1; 3/1) thu được chất số 5 (9 mg). Như vậy qua bước này chúng tôi đã thu được 5 chất kí hiệu từ RG1 đến RGT5. Các chất này đã được kiểm tra độ tinh sạch bằng sắc kí bản mỏng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và xác định công thức cấu tạo ở các bước tiếp theo. Kết quả kiểm tra độ tinh sạch của 5 hợp chất tách từ cây Rau gai thối bằng sắc kí bản mỏng trên silica gel (Hình 3.9) cho thấy mỗi chất chỉ có một băng trên sắc kí bản mỏng chứng tỏ các hợp chất này đã được tinh sạch. 13
Hình 3.9. Sắc ký đồ SKLM của 5 chất tách từ cây Rau gai thối A: RGT1, B: RGT2, C: RGT3, D: RGT4, E: RGT5 Kết quả phân tích khả năng ức chế pepsin và protease HIV-1 của 5 hợp chất tách được từ cây Rau gai thối (Hình 3.10) cho thấy chất RGT3 và chất RGT4 ức chế pepsin rõ rệt ở nồng độ từ 5- 50 mg/ml (Hình 3.10A giếng 8 và 10) và ức chế 50% hoạt tính protease HIV-1 tại nồng độ 6,5 µg/ml với chất RGT1 (Hình 3.10B), tại nồng độ 7 µg/ml với chất RGT2 (Hình 3.10C), tại nồng độ 17 µg/ml với chất RGT3 (Hình 3.10D), tại nồng độ 15 µg/ml với chất RGT4 (Hình 3.10E) và tại nồng độ 2,3 µg/ml với chất RGT5 (Hình 3.10F). Như vậy, trong số 5 hợp chất thì chỉ có các hợp chất RGT3 và chất RGT5 ức chế pepsin, nhưng cả 5 hợp chất đều là những chất ức chế protease HIV-1. Hình 3.10. A: Khả năng ức chế pepsin của các chất tinh sạch từ cây Rau gai thối. Giếng 1: HCl 0,01 N, giếng 2: DMSO, giếng 3: pepsin, giếng 4: pepsin + DMSO, giếng 5: pepsin + pepstatin A, giếng 6: pepsin + RGT1, giếng 7: pepsin + RGT2, giếng 8: pepsin + 14
RGT3, giếng 9: pepsin + RGT4 và giếng 10: pepsin + chất RGT5 với nồng độ 50 mg/ml. Hoạt tính còn lại của protease HIV-1 khi có mặt của (B: RGT1, C: RGT2, D: RGT3, E: RGT4, F: RGT5 ) trong phản ứng. Tiếp theo, chúng tôi đã tiến hành phân tích các tính chất vật lý và phổ NMR, IR, ESI-MS của các hợp chất thu được từ cây Rau gai thối. Hợp chất số 1: ở dạng bột màu trắng ngà. Phổ IR (cm-1): 3285; 1644; 1618; 1540; 1445; 1248; 1038. Phổ APCI-MS (m/z)=521 [M-H]-. Phổ 1H- NMR (CD3OD; 500 MHz): 6,95 (1H, d, J=2,0 Hz, H-2′), 6,94 (1H, d, J=1,5 Hz, H-6′), 6,60 (1H, d, J=8,0 Hz, H-5), 6,59 (1H, d, J=2,5 Hz, H-2), 6,58 (1H, d, J=16,5 Hz, H-7′), 6,50 (1H, dd, J=2,0; 8,0 Hz, H-6), 6,33 (1H, dt, J=6,0; 16,5 Hz, H-8′), 4,70 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1′′), 4,24 (2H, d, J=5,5 Hz, H-9′), 3,98 (1H, m, H-8), 3,85 (3H, s, H-10′), 3,82 (1H, m, H-6a′′), 3,79 (1H, m, H-9a), 3,72 (3H, s, H-10), 3,70 (1H, m, H-9b), 3,68 (1H, m, H- 6b′′), 3,48 (1H, m, H-4′′), 3,45 (1H, m, H-3′′), 3,39 (1H, m, H-2′′), 3,15 (1H, m, H-5′′), 2,98 (1H, dd, J=5,5; 14,0 Hz, H-7a), 2,74 (1H, dd, J=9,0; 13,5 Hz, H-7b). Phổ 13C-NMR (CD3OD; 125 MHz): 153,5 (C-3′), 148,4 (C- 3), 145,4 (C-4), 145,0 (C-4′), 138,9 (C-5′), 135,4 (C-1′), 133,2 (C-1), 131,5 (C-7′), 129,7 (C-8′), 122,6 (C-6), 119,1 (C-6′), 115,7 (C-2), 113,8 (C-5), 109,1 (C-2′), 105,4 (C-1′′), 78,1 (C-5′′), 77,9 (C-3′′), 75,9 (C-2′′), 71,2 (C- 4′′), 66,8 (C-9), 63,7 (C-9′), 62,5 (C-6′′), 56,4 (C-10), 56,3 (C-10′′), 42,8 (C- 8), 39,2 (C-7). Hợp chất số 1: thu được dưới dạng bột màu trắng ngà. Phổ IR cho biết trong phân t 1 có các nhóm chức: nhóm OH (dải hấp thụ có đỉnh 3285 cm-1), liên kết C=C (1644 cm-1), liên kết C=C nhân thơm (1618; 1540; 1445 cm-1), liên kết C-O (1248; 1038 cm-1). Phổ khối ESI-MS có píc ion tại m/z: 521 [M-H] (negative) cho biết khối lượng phân t của 1 là M=522. Phổ 1H-NMR của 1 xuất hiện tín hiệu của 02 proton olefin, một proton xuất hiện dưới dạng doublet với hằng số ghép cặp J=16,5 Hz ở δH=6,58 ppm và một proton xuất hiện dưới dạng double triplet với J=6,0; 16,5 Hz ở độ chuyển dịch δH=6,33 ppm. Hai tín hiệu này được xác định là các proton của liên kết đôi với cấu hình trans. Quan sát trên phổ 1H-NMR của 1 còn xuất hiện tín hiệu của 05 proton thơm và 02 proton methoxy ở δH=3,85 và 3,72 ppm. Năm proton thơm bao gồm 02 proton ghép cặp dưới dạng meta và 03 proton ghép cặp dưới dạng ABX. Phổ 13C-NMR của 1 xuất hiện tín hiệu của 26 nguyên t cacbon trong đó có 14 nguyên t cacbon của liên kết đôi hay nhân thơm. ết hợp với dữ kiện phổ 1H-NMR khẳng định hợp chất 1 có 2 v ng thơm. Sự có mặt của gốc đường với cấu hình β trong cấu trúc của 1 được thể hiện thông qua tín hiệu của proton anome ở δH 4,70 (d, J=7,5 Hz, H-1′′) và tín hiệu δC=62,5 ppm (C-6′′). Gốc đường này được đính vào cacbon ở độ chuyển dịch δC=145,0 (C-4′) do xuất hiện tương tác của δH=4,70 và δC=145,0 trên phổ HMBC. Ngoài ra, khi quan sát các phổ 1H 15
và 13C-NMR, DEPT cho thấy, phần aglycon của hợp chất 1 còn có thêm 01 nhóm methylen,01 nhóm methin và 02 nhóm oxymethylen. Phân tích các dữ kiện phổ, tra cứu tài liệu, dự đoán chất số 1 là hợp chất icariside E5 (Lee và tập thể, 2009, Iorizzi và tập thể, 2001). Các tương tác trên phổ 2D-NMR (HMBC, HSQC, COSY) và phổ khối đều khẳng định chất số 1 là hợp chất icariside E5. Icariside E5 là một lignan glycosid, lần đầu tiên được phân lập từ phần trên mặt đất của loài Epimedium diphyllum vào năm 1989 (Miyase và tập thể, 1989). Sau đó, hợp chất này được tìm thấy trong một số loài thực vật như Albizzia julibrissin, Ehretia ovalifolia, Capsicum annuum (Lee và tập thể, 2009, Iorizzi và tập thể, 2001). Đây là lần đầu tiên sự có mặt của hợp chất icariside E5 trong một loài thuộc chi Acacia được công bố (Hình 3.11,1). Hợp chất số 2: thu được ở dạng bột màu trắng. Phổ IR (cm-1): 3454; 2930; 1691; 1615; 1270; 1048. Phổ ESI-MS (m/z)=489 [M+H]+. Phổ 1H- NMR (CD3OD; 500 MHz): 5,30 (1H, br s, H-12), 4,13 (1H, d, J=11,0 Hz, H-24), 3,40 (1H, d, J=6,0 Hz, H-24b), 3,37 (1H, m, H-3), 2,52 (1H, br s, H- 18), 1,35 (3H, s, H-27), 1,22 (3H, s, H-23), 1,21 (3H, s, H-29), 0,95 (3H, d, J=6,5 Hz, H-30), 0,94 (3H, s, H-26), 0,80 (3H, s, H-25). Phổ 13C-NMR (CD3OD; 125 MHz): 182,3 (C-28), 140,0 (C-13), 129,3 (C-12), 81,3 (C- 3),73,6 (C-19), 65,3 (C-24), 57,3 (C-5), 55,1 (C-18), 43,5 (C-4), 43,1 (C- 20), 42,5 (C-14), 41,0 (C-8), 39,6 (C-1), 39,0 (C-22), 37,9 (C-10), 34,5 (C- 7), 29,6 (C-15), 28,3 (C-2), 27,3 (C-29), 27,1 (C-21), 26,6 (C-16), 24,9 (C- 27), 24,7 (C-11), 23,2 (C-23), 19,9 (C-6), 17,4 (C-25), 16,6 (C-26), 16,4 (C- 30). Hợp chất số 2: thu được dưới dạng bột màu trắng. Phổ IR của 2 xuất hiện các đỉnh hấp thụ: 3454 cm-1 (nhóm OH), 1691 cm-1 (nhóm C=O), 1270; 1048 cm-1 (liên kết C-O). Phổ 1H-NMR của 2 xuất hiện tín hiệu của 01 proton olefin ở δH=5,30 ppm, 01 nhóm oxymethin ở δH=3,37 ppm, một nhóm oxymethylen, 06 nhóm methyl trong đó có 05 nhóm xuất hiện dưới dạng píc đơn và 01 nhóm xuất hiện dưới dạng píc kép với hằng số ghép cặp J=6,5 Hz. Phổ 13C-NMR và phổ DEPT xuất hiện tín hiệu của 30 nguyên t cacbon trong đó hai nguyên t cacbon của liên kết đôi lần lượt xuất hiện ở δc=140,3 ppm (C) và 129,3 ppm (CH). Trong số 30 nguyên t cacbon có 06 nhóm methyl, 10 nhóm methylen, 06 nhóm methyl và 08 cacbon bậc bốn. Các dữ kiện phổ NMR của chất số 2 gần giống với dữ kiện phổ của hợp chất axit ursolic, một triterpenoid khung ursan thường gặp trong thực vật (Hossain và Ismail , 2013). Điểm khác biệt giữa chất số 2 và hợp chất axit ursolic là chất số 2 có ít hơn hợp chất axit ursolic một nhóm methyl. Trong cấu trúc của chất số 2, nhóm methyl này đã được thay thế bằng nhóm oxymethylen. Nhóm oxymethylen được xác định là ở vị trí 24 do xuất hiện tương tác δH=1,22 ppm (H-23) và δC=65,3 ppm (C-24) cũng như δH=3,40; 4,13 ppm (H-24) và δC=23,2 ppm (C-23) trên phổ HMBC. Ngoài việc ít 16
hơn hợp chất axit ursolic một nhóm methyl, hợp chất 2 chỉ xuất hiện một proton methyl dưới dạng doublet với hằng số ghép cặp J=6,5 Hz thay vì hai proton methyl (H-29 và H-30) như trong hợp chất axit ursolic (Hossain và Ismail , 2013). Như vậy, C-19 hoặc C-20 trong chất số 2 đã chuyển thành cacbon bậc bốn thay vì cả hai là nhóm CH như trong axit ursolic. Điều này được thể hiện qua sự xuất hiện cacbon bậc bốn ở δC=73,6 ppm trên phổ 13C- NMR và phổ DEPT. Cacbon này được xác định là cacbon ở vị trí C-19 do xuất hiện tương tác của δH=1,21 ppm (H-29) và δC=73,6 ppm (C-19) cũng như δH=2,52 ppm (H-18) và δC=73,6 ppm (C-19) khi quan sát phổ HMBC (Nakatani và tập thể, 1989a). Phổ khối ESI-MS có píc ion tại m/z: 489 [M+H] + (positive) cho biết công thức phân t của 2 là C30H48O5 (M=488). Phân tích các dữ kiện phổ, xác định chất số 2 là hợp chất 3β,19,24- trihydroxyurs-12-en-28-oic acid, hay còn là axit rotungenic (Nakatani và tập thể, 1989a, 1989b). Hợp chất axit rotungenic lần đầu tiên được phân lập vào năm 1989 từ quả của loài Ilex rotunda bởi các nhà khoa học Nhật Bản (Nakatani và tập thể, 1989a). Đây là lần đầu tiên hợp chất này được tìm thấy trong chi Acacia (Hình 3.11,2). Hợp chất số 3: ở dạng bột màu trắng. Phổ IR (cm-1): 3423; 2938; 1646; 1185; 1044. Phổ ESI-MS (m/z)=801 [M+H]+. Phổ 1H-NMR (CD3OD; 500 MHz): 5,13 (1H, t, J=6,5 Hz, H-24), 4,62 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1′′), 4,37 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1′), 4,12 (1H, dt, J=3,0 Hz ), 1,70 (3H, s, H-26), 1,65 (3H, s, H-27), 1,37 (3H, s, H-21), 1,35 (3H, s, H-28), 1,12 (3H, s, H-18), 1,03 (3H, s, H-29), 1,02 (3H, s, H-19), 0,98 (3H, s, H-30). Phổ 13C-NMR (CD3OD; 125 MHz): 130,3 (C-25), 125,8 (C-24), 105,6 (C-1′), 98,3 (C-1′′), 84,9 (C-20), 80,9 (C-6), 79,8 (C-3), 79,1 (C-3′), 78,3 (C-3′′), 77,9 (C-5′′), 77,7 (C-5′), 75,5 (C-2′), 75,4 (C-2′′), 71,7 (C-12), 71,4 (C-4′), 71,3 (C-4′′), 62,9 (C-6′), 62,7 (C-6′′), 61,8 (C-5), 53,1 (C-17), 52,5 (C-14), 50,6 (C-9), 49,8 (C-13), 45,2 (C-7), 41,9 (C-8), 40,5 (C-10), 40,4 (C-4), 40,2 (C-1), 36,6 (C-22), 31,5 (C-15), 31,4 (C-28), 30,9 (C-11), 27,6 (C-16), 27,2 (C- 12), 25,8 (C-26), 24,2 (C-23), 22,8 (C-21), 17,9 (C-27), 17,8 (C-19), 17,6 (C-18), 17,1 (C-30), 16,1 (C-29). Hợp chất số 3: thu được dưới dạng bột màu trắng. Các phổ 1H, 13C- NMR, DEPT, HSQC, HMBC của chất số 3 cho biết đây là một saponin triterpenoid tetracyclic khung dammaran với hai gốc đường trong cấu trúc (Lin và tập thể, 2001, Teng và tập thể, 2002). Cả hai gốc đường có cấu hình β do hai proton anome đều xuất hiện dưới dạng doublet ở δH=4,37 ppm (H- 1′) và δH=4,62 ppm (H-1′′) với hằng số ghép cặp J=7,5 Hz. Gốc đường thứ nhất được xác định là đính vào vị trí C-6 của khung aglycon do xuất hiện tương tác của δH=4,37 ppm (H-1′) và δC=80,9 ppm (C-6), gốc đường còn lại được xác định là đính vào vị trí C-20 của khung aglycon do xuất hiện tương tác δH=4,62 ppm (H-1′′) và δC=84,9 ppm (C-20) khi quan sát trên phổ HMBC. Phổ khối ESI-MS có píc ion tại m/z: 801 [M+H]+ (positive), kết 17
hợp với dữ kiện phổ NMR cho biết công thức phân t của 3 là C42H72O14 (M=800). Phân tích các dữ kiện phổ, tham khảo tài liệu xác định chất số 3 là hợp chất ginsenoside Rg1 (Lin và tập thể, 2001, Teng và tập thể, 2002). Hợp chất ginsenoside Rg1 là thành phần chính trong các loài thuộc chi Panax thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae) (Wan và tập thể, 2012). Đây là lần đầu tiên phát hiện sự có mặt của hợp chất này trong thành phần hóa học của một loài thuộc chi Acacia (Hình 3.11,3) . Hợp chất số 4: ở dạng bột màu trắng. Phổ IR (cm-1): 3545; 2923; 1651; 1185; 1262; 1063. Phổ ESI-MS (m/z)=1043 [M-H]-. Phổ 1H-NMR (CD3OD; 500 MHz): 5,14 (1H, br s, H-12); 3,21 (1H, H-3, overlap), 4,57 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1′′), 4,45 (1H, d, J=5,5 Hz, H-1′′′), 4,34 (1H, d, J=7,0 Hz, H-1′), 4,44 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1′′′′), 1,09 (3H, s, H-27); 0,99 (3H, s, H-23), 0,86 (3H, s, H-25), 0,85 (3H, s, H-30), 0,81 (3H, s, H-29), 0,77 (3H, s, H-24), 0,73 (3H, s, H-26). Phổ 13C-NMR (CD3OD; 125 MHz): 145,2 (C- 13), 123,6 (C-12), 106,7 (C-1′′′′), 105,2 (C-1′), 104,6 (C-1′′), 103,7 (C-1′′′), 90,6 (C-3), 81,6 (C-2′′′), 81,1 (C-2′), 78,4 (C-3′), 78,4 (C-5′′), 77,9 (C-3′′), 77,6 (C-3′′′′), 76,8 (C-5′), 76,4 (C-2′′), 75,9 (C-2′′′′), 73,3 (C-3′′′), 71,9 (C- 4′′), 71,6 (C-4′), 71,1 (C-4′′′′), 69,9 (C-6′), 68,7 (C-4′′′), 67,3 (C-5′′′′), 65,7 (C-5′′′), 63,1 (C-6′), 57,0 (C-5), 49,1 (C-9), 47,2 (C-17), 42,9 (C-14), 42,7 (C-18), 40,6 (C-8), 40,5 (C-1), 39,8 (C-4), 37,9 (C-10), 35,0 (C-15), 34,0 (C-7), 33,6 (C-29), 31,6 (C-20), 29,0 (C-22), 28,4 (C-23), 27,3 (C-2), 26,5 (C-27), 24,6 (C-16), 24,6 (C-11), 24,0 (C-30), 19,3 (C-6), 18,2 (C-26), 16,9 (C-24), 16,0 (C-25). Hợp chất số 4: thu được dưới dạng bột màu trắng. Phổ IR cho biết trong phân t 1 có các nhóm chức: nhóm OH (dải hấp thụ có đỉnh 3545 cm- 1 ), liên kết C=O (1651 cm-1), liên kết C-O (1262; 1063 cm-1). Các phổ 1H- NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC của 4 cho biết hợp chất này là một saponin khung olean, một thành phần chính trong các loài thuộc phân họ Trinh nữ (Mimosoideae) (Lacaille-Dubois và tập thể, 2011). Cấu trúc của hợp chất 4 chứa 04 gốc đường, trong đó có 03 đường cấu hình β do trên phổ 1 H-NMR xuất hiện tín hiệu của 03 proton anome xuất dưới dạng doublet với hằng số ghép cặp J ˃7 ppm. Đường còn lại có cấu hình α do proton anome xuất hiện ở δH=4,45 (d, H-1′′′) với hằng số ghép cặp J=5,5 Hz. Sự xuất hiện tương tác của proton anome δH=4,34 ppm (H-1′) và δc=90,6 ppm khi quan sát trên phổ HMBC gợi ý rằng vị trí số 3 trong khung aglycon được gắn bởi các gốc đường. Tìm kiếm các hợp chất saponin với những đặc điểm đã nêu ở trên, nhóm nghiên cứu dự đoán chất số 4 là hợp chất oleanolic acid 3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl- (1→6)-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranosid, hay còn gọi là hợp chất pitheduloside G (Nigam và tập thể, 1997, Seo và tập thể, 2002). Các tương tác xuất hiện trên phổ HMBC giúp khẳng định vị trí đính của các gốc đường với trung tâm thế ở vị trí C-3. Theo đó, đường β-D- 18