Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu ở mức độ phân tử khả năng kháng carbapenem của một số vi khuẩn Gram âm phân lập từ bệnh nhân tại Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Quân đội 108

Chia sẻ: Acacia2510 _Acacia2510 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

19
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của luận án là phát hiện được các gen carbapenemase ở các chủng vi khuẩn E. coli, K. pneumoniae, A. baumannii kháng carbapenem phân lập tại Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Trung ương Quân đội 108. Xác định được một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn mang gen carbapenemase phân lập tại Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Trung ương Quân đội 108.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu ở mức độ phân tử khả năng kháng carbapenem của một số vi khuẩn Gram âm phân lập từ bệnh nhân tại Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Quân đội 108

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN DIỆU LINH NGHIÊN CỨU Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ KHẢ NĂNG KHÁNG CARBAPENEM CỦA MỘT SỐ VI KHUẨN GRAM ÂM PHÂN LẬP TỪ BỆNH NHÂN TẠI BỆNH VIỆN VIỆT ĐỨC VÀ BỆNH VIỆN QUÂN ĐỘI 108 Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62420107 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2017
Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội và Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Đặng Đức Anh 2. GS. TS. Phạm Văn Ty Phản biện 1: ..................................................................... ..................................................................... Phản biện 2: ..................................................................... ..................................................................... Phản biện 3: ..................................................................... ..................................................................... Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án Tiến sĩ họp tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên vào hồi giờ .…, ngày ..…tháng ...…năm 201..... Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam; - Trung tâm thông tin thư viện - Đại học Quốc gia Hà Nội
MỞ ĐẦU Vi khuẩn kháng kháng sinh là một vấn đề nghiêm trọng và đóng vai trò trọng tâm trong công tác chăm sóc sức khoẻ con người trên toàn thế giới. Sự quan ngại ngày càng lớn do sự xuất hiện và lây lan nhanh chóng của các chủng vi khuẩn kháng carbapenem, hiện vẫn được coi là kháng sinh thuộc “nhóm lựa chọn cuối cùng” điều trị các trường hợp nhiễm trùng do vi khuẩn đa kháng thuốc gây ra trong các bệnh viện. Do vậy vấn đề này đã và đang giành được sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học trên thế giới với số lượng các nghiên cứu về vi khuẩn kháng kháng sinh ngày một tăng. Việt Nam nằm trong khu vực châu Á được xem là "điểm nóng" của vi khuẩn kháng kháng sinh. Hiện nay các báo cáo cho thấy vi khuẩn Gram âm đã kháng lại carbapenem trong các bệnh viện ở mức độ cao. Một số nghiên cứu đã chỉ ra vai trò của các gen NDM-1, KPC, OXA- 23 và OXA-58 trong cơ chế kháng carbapenem của vi khuẩn Gram âm được phân lập tại một số bệnh viện ở Việt Nam và bước đầu xác định được một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của các vi khuẩn kháng carbapenem phân lập được. Để giải quyết các vấn đề còn tồn tại từ các nghiên cứu trước đây như: sự tồn tại của các gen mã hoá sinh tổng hợp enzyme carbapenemase (gọi tắt là gen carbapenemase) khác; mối liên hệ về kiểu gen, sequence type (ST) giữa các chủng mang gen kháng ở Việt Nam và trên thế giới đặc biệt là trong bối cảnh giao thông và du lịch phát triển mạnh, tạo cơ hội cho sự lây lan của các chủng kháng trên phạm vi thế giới; và đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn Gram âm kháng carbapenem phân lập trong những bệnh viện lớn tại Việt Nam, chúng tôi đã sử dụng các kỹ thuật tiên tiến nhất để thực hiện đề tài: "Nghiên cứu ở mức độ phân tử khả năng kháng 1
carbapenem của một số vi khuẩn Gram âm phân lập từ bệnh nhân tại Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Quân đội 108". MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1. Phát hiện được các gen carbapenemase ở các chủng vi khuẩn E. coli, K. pneumoniae, A. baumannii kháng carbapenem phân lập tại Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Trung ương Quân đội 108. 2. Xác định được một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn mang gen carbapenemase phân lập tại Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Trung ương Quân đội 108. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN - Kết quả nghiên cứu cho thấy vai trò của cơ chế sinh carbapenemase trong đặc tính kháng carbapenem của vi khuẩn Gram âm phân lập tại bệnh viện, qua đó bổ sung các số liệu quan trọng ở mức độ phan tử về thực trạng kháng carbapenem ở Việt Nam. - Luận án cung cấp các thông tin hữu ích về nguồn gốc và sự lây lan của các chủng vi khuẩn Gram âm kháng carbapenem tại các địa điểm nghiên cứu và mối quan hệ với các chủng kháng trên thế giới. - Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học để đưa ra các biện pháp kiểm soát nhiễm khuẩn hiệu quả trong bệnh viện, đồng thời góp phần giảm gánh nặng và nguy cơ lan truyền vi khuẩn kháng thuốc ra ngoài cộng đồng. - Việc áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến nhất trên thế giới vào nghiên cứu này góp phần nâng cao được năng lực của NCS nói riêng và của toàn nhóm nghiên cứu nói chung cũng như chất lượng các công trình nghiên cứu ngang tầm với các quốc gia khác trong khu vực và trên thế giới. 2
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Là nghiên cứu đầu tiên áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến nhất hiện nay (giải trình tự toàn bộ hệ gen của vi khuẩn) để xác định cơ chế kháng carbapenem ở mức độ phân tử bằng sinh tổng hợp enzyme carbapenemase của một số chủng vi khuẩn Gram âm gây nhiễm trùng phổ biến được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm lâm sàng. - Kết quả nghiên cứu cho thấy một bức tranh rõ nét hơn về mối liên hệ kiểu gen, sequence type giữa các chủng vi khuẩn kháng carbapenem trong nghiên cứu này với các chủng vi khuẩn sinh carbapenemase của một số bệnh viện khác tại Hà Nội và trên thế giới. - Nghiên cứu đầu tiên về đặc điểm phân tử của các plasmid và yếu tố di truyền di động mang gen carbapenemase. CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN Luận án bao gồm 130 trang không kể tài liệu tham khảo và phụ lục; gồm 3 chương, 37 hình, 10 bảng, 234 tài liệu tham khảo (14 tài liệu tiếng Việt, 220 tài liệu tiếng Anh). Bố cục luận án gồm: Mở đầu 4 trang, Tổng quan 37 trang, Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 15 trang, Kết quả và bàn luận 59 trang, Kết luận 1 trang, Kiến nghị 1 trang; 4 bài báo có liên quan trực tiếp đến luận án đã được công bố. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Vi khuẩn Gram âm và tính kháng kháng sinh 1.1.1. Vi khuẩn Gram âm Vi khuẩn Gram âm là một nhóm vi khuẩn có lớp màng kép, có nhiều gen quan trọng nằm trên những ADN vòng tách biệt, rải rác trong nguyên sinh chất của vi khuẩn gọi là các plasmid. Plasmid thường chứa các gen sản xuất kháng sinh, một số gen sản xuất các loại độc tố và các protein có hoạt tính cao có chức năng tăng cường độc 3
lực cho vi khuẩn. Plasmid là công cụ giúp vận chuyển ADN từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác thông qua hiện tượng truyền gen ngang nên chúng đóng vai trò quan trọng trong lĩnh vực y, sinh, nông, dược và môi trường. 1.1.2. Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm Tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn có thể bắt nguồn từ hai yếu tố: yếu tố di truyền quy định tính đề kháng của vi sinh vật và hoạt tính của kháng sinh đã ức chế các vi khuẩn nhạy và chọn lọc những vi khuẩn kháng. Tính đề kháng sẽ phát triển khi có mặt đồng thời 2 yếu tố này trong môi trường hoặc vật chủ. Các gen quy định đặc tính kháng và tế bào vi khuẩn sẽ cùng nhân lên và lan rộng dưới áp lực chọn lọc của kháng sinh có trong môi trường. 1.1.3. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm thường được phân thành 3 nhóm cơ chế chính: làm giảm sự hấp thụ kháng sinh vào bên trong tế bào vi khuẩn, thay đổi đích tác động của kháng sinh và sản sinh ra các enzyme để ức chế hoặc biến đổi kháng sinh. 1.1.4. Cơ sở di truyền học của cơ chế kháng kháng sinh Đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn có thể là đề kháng tự nhiên hoặc đề kháng thu được. Đề kháng tự nhiên là đặc điểm sinh học của một loài, thường có được do yếu tố di truyền với mục đích bảo vệ vi khuẩn khỏi tác động của kháng sinh. Đề kháng thu được là đề kháng có được nhờ đột biến gen, nhận được gen đề kháng từ bên ngoài thông qua truyền gen ngang hoặc kết hợp cả 2 cơ chế này. 4
1.2. Kháng sinh nhóm carbapenem và cơ chế kháng kháng sinh nhóm carbapenem của vi khuẩn Gram âm 1.2.1. Kháng sinh nhóm carbapenem Kháng sinh nhóm carbapenems được xem là “sự lựa chọn cuối cùng”, thường được chỉ định điều trị các trường hợp nhiễm trùng nặng hoặc nhiễm trùng do vi khuẩn kháng kháng sinh phổ rộng. Cơ chế tác động của kháng sinh nhóm carbapenem là gắn và bất hoạt protein gắn penicillin (PBP), qua đó ức chế quá trình hình thành peptidoglycan của thành tế bào vi khuẩn. 1.2.2. Cơ chế đề kháng kháng sinh nhóm carbapenem của vi khuẩn Gram âm Ba cơ chế đề kháng carbapenem phổ biến ở vi khuẩn Gram âm bao gồm: các gen nằm trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid mã hóa sinh tổng hợp các enzyme carbapenemase phân giải phân tử carbapnenem; tạo ra các đột biến làm giảm tính thấm của màng tế bào thông qua việc thay đổi biểu hiện và/ hoặc hoạt động của các lỗ màng và phân tử PBP; và sử dụng bơm đẩy để bơm kháng sinh ra ngoài tế bào vi khuẩn. Trong các cơ chế này, cơ chế sinh tổng hợp carbapenemase là cơ chế phổ biến và được nghiên cứu sâu rộng nhất. Các enzyme carbapenemase được phát hiện chủ yếu thuộc nhóm A (ví dụ như enzyme KPC và GES), nhóm B metallo-β-lactamase (ví dụ như enzyme VIM, IMP và NDM) và nhóm D (ví dụ các enzyme họ OXA như OXA-23, OXA-48, OXA-51, OXA-58, OXA-181). Đối với các vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, các carbapenemase có ý nghĩa lâm sàng nhất bao gồm KPC (nhóm A), VIM, IMP, NDM (nhóm B) và OXA-48 (nhóm D). 5
1.3. Một số phương pháp hiện đại ứng dụng trong nghiên cứu cơ chế đề kháng carbapenem ở mức độ phân tử và khả năng lan truyền của các chủng vi khuẩn mang gen kháng Các phương pháp nghiên cứu đặc tính và cơ chế kháng carbapenem ở mức độ phân tử của các chủng vi khuẩn kháng thuốc bao gồm: kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR); thử nghiệm Hodge test cải tiến bổ sung Triton (Triton Hodge Test - THT) và Carba NP cải tiến; S1-PFGE kết hợp với Southern blotting; phân loại plasmid và giải trình tự gen. Các phương pháp nghiên cứu khả năng lan truyền của các chủng vi khuẩn mang gen kháng bao gồm: phương pháp điện di xung trường (PFGE), phân loại trình tự đa vị trí (MLST) và tiếp hợp. 1.4. Tình hình kháng kháng sinh nhóm carbapenem của vi khuẩn Gram âm trên thế giới và tại Việt Nam 1.4.1. Tình hình kháng kháng sinh nhóm carbapenem của vi khuẩn Gram âm trên thế giới Các kháng sinh thế hệ mới đắt tiền, thậm chí ngay cả một số kháng sinh thuộc “nhóm lựa chọn cuối cùng” như nhóm carbapenem đang mất dần hiệu lực. Vi khuẩn mang gen carbapenemase nhóm A, B và D đã xuất hiện trên toàn thế giới ở cả mức độ gây ra những vụ dịch lớn hoặc các trường hợp riêng rẽ. 1.4.2. Tình hình kháng kháng sinh nhóm carbapenem của vi khuẩn Gram âm tại Việt Nam Tại Việt Nam, vi khuẩn Gram âm đã kháng lại kháng sinh ở mức độ cao. Tại 6 bệnh viện vào năm 2008 đã ghi nhận mức độ kháng carbapenem của các chủng P. aeruginosa là 20% và của các chủng A. baumannii là gần 50%. Theo một nghiên cứu mới nhất ở bệnh nhân nhi thuộc Khoa hồi sức cấp cứu tại 3 bệnh viện tuyến đầu của Việt 6
Nam đã cho thấy tỉ lệ kháng carbapenem ở các chủng K. pneumoniae, P. aeruginosa và A. baumannii lần lượt là 55%, 71% và 65%. Các nghiên cứu về cơ chế kháng carbapenem tại Việt Nam cho thấy sự xuất hiện của các gen NDM-1, KPC, OXA-23, OXA-51 và OXA- 58 ở các chủng vi khuẩn đường ruột và A. baumannii phân lập tại một số bệnh viện lớn. Tỉ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh nhóm carbapenem đang có xu hướng tăng và ngày càng lan rộng ở Việt Nam. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm nghiên cứu Chọn có chủ đích Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Trung ương Quân đội (TƯQĐ) 108. 2.2. Thiết kế nghiên cứu Mô tả và phân tích trong phòng thí nghiệm. 2.3. Thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện trong giai đoạn từ năm 2015 đến năm 2017. Địa điểm thực hiện: Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương và Đơn vị nghiên cứu lâm sàng Oxford tại Hà Nội (OUCRU), Việt Nam; Trường Đại học Cardiff và Trường Đại học Oxford, Vương quốc Anh; Viện Nghiên cứu Quốc gia các bệnh truyền nhiễm, Nhật Bản. 2.4. Đối tượng và cỡ mẫu nghiên cứu 622 chủng vi khuẩn E. coli, K. pneumoniae, A. baumannii phân lập từ mẫu bệnh phẩm tại 2 bệnh viện Việt Đức và TƯQĐ 108 cho kết quả kháng sinh đồ kháng với ít nhất một loại kháng sinh thuộc nhóm carbapenem. 2.6. Phương pháp nghiên cứu Nuôi cấy vi khuẩn; tách chiết ADN; phản ứng PCR; Hodge test và Carba NP cải tiến; thử nghiệm xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu 7
ức chế sự phát triển của vi khuẩn (MIC); PFGE; giải trình tự toàn bộ hệ gen của vi khuẩn (WGS); S1-PFGE và Southern blotting; tiếp hợp vi khuẩn. 2.7. Xử lý và phân tích số liệu Phần mềm Excel và các phần mềm tin sinh học chuyên dụng khác. 2.9. Đạo đức trong nghiên cứu Mọi thông tin cá nhân của bệnh nhân đều được bảo mật. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1. Một số đặc điểm chung của các chủng vi khuẩn phân lập tại 2 bệnh viện Tổng số chủng vi khuẩn thu thập trong giai đoạn nghiên cứu là 622 chủng trong đó từ Bệnh viện Việt Đức là 318 chủng và từ Bệnh viện TƯQĐ 108 là 304 chủng. Trong tổng số 622 chủng thu thập được, A. baumannii chiếm tỉ lệ lớn nhất là 53% (n=330), tiếp theo là K. pneumoniae 26% (n=162) và thấp nhất là E. coli với 21% (n=130). Tỉ lệ A. baumannii kháng carbapenem rất cao phù hợp với các công bố trước đây về tỉ lệ chủng A. baumannii chiếm ưu thế tại các bệnh viện của Việt Nam. 3.2. Phát hiện các gen mã hoá khả năng sinh tổng hợp enzyme carbapenemase ở các chủng vi khuẩn kháng carbapenem phân lập tại 2 bệnh viện Trong 3 loại vi khuẩn nghiên cứu, chủng A. baumannii có tỷ lệ mang gen carbapenemase cao nhất với 92,12% (304/330 chủng), tiếp theo là K. pneumoniae với 54,32% (88/162 chủng) và cuối cùng là E. coli với 30,0% (39/130 chủng) (Bảng 3.2). Điều này cho thấy nhiều khả năng cơ chế kháng kháng sinh nhóm carbapenem chủ yếu của các chủng A. baumannii và K. pneumoniae phân lập tại Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện TƯQĐ 108 là thông qua việc sinh tổng hợp enzyme 8
carbapenemase, phù hợp với kết quả của một số nghiên cứu khác tại Việt Nam và trên thế giới. Kết quả cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập tại 2 bệnh viện mang các gen carbapenemase thuộc cả 3 nhóm: nhóm A (KPC), nhóm B (NDM, IMP) và nhóm D (OXA-48, OXA-23 và OXA-58) (Bảng 3.2). Bảng 3.2: Số lượng chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang các gen carbapenemase Gen OXA-23 là gen carbapenemase phổ biến nhất chiếm 45% (280/622 chủng) tuy nhiên lại chỉ được tìm thấy ở A. baumannii. Gen NDM đứng thứ 2 với 19,8% (123/622 chủng) nhưng lại được tìm thấy ở cả 3 loại vi khuẩn, phù hợp với các phát hiện trước đây tại Việt Nam và trên thế giới. Các gen khác chỉ xuất hiện với số lượng hạn chế: OXA-58 ở A. baumannii (n=20; 3,2%), KPC và OXA-48 đều có ở E. coli và K. pneumoniae với tỉ lệ lần lượt là 2,9% (n=18) và 1,6% (n=10). Đây là báo cáo đầu tiên về sự có mặt của gen KPC ở chủng E.coli và gen OXA-48 ở các chủng vi khuẩn đường ruột phân lập tại các bệnh viện của Hà Nội. 13 trong tổng số 622 chủng mang đồng thời 2 hoặc 3 gen carbapenemase khác nhau cho thấy nguy cơ xảy ra hiện tượng tái tổ hợp giữa các plasmid mang gen dẫn đến việc các gen kháng khác nhau sẽ nằm trên cùng 1 plasmid. Gen NDM có 4 biến thể mới gồm: NDM-1, NDM-4, NDM-6, NDM-9; OXA-48 có 1 biến thể OXA-181. Sự xuất hiện của các biến 9
thể cho thấy các gen carbapenemase đã và đang biến đổi cùng với sự tiến hoá tính đề kháng của các chủng vi khuẩn. Tất cả các chủng E. coli và K. pneumoniae được giải trình tự toàn bộ hệ gen đều chứa ít nhất 1 gen mã hoá sinh tổng hợp ESBL điển hình như TEM, SHV và CTX; gen mã hoá khả năng kháng nhiều nhóm kháng sinh khác như quinolones, aminoglycoside, sulphonamide v.v. Việc phát hiện được nhiều loại gen carbapenemase phổ biến trên thế giới trong các chủng vi khuẩn phân lập tại bệnh viện ở Việt Nam đã cho thấy tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh ở Việt Nam thực sự là vấn đề rất cấp thiết, cần được kiểm soát chặt chẽ. 3.3. Xác định khả năng sinh carbapenemase và mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn mang gen 3.3.1. Xác định khả năng sinh carbapenemase của các chủng vi khuẩn mang gen Kết quả thử nghiệm có > 90% số chủng E. coli và K. pneumoniae cho kết quả dương tính với thử nghiệm Hodge test cải tiến bổ sung Triton (THT) còn ở A. baumannii tỉ lệ này chỉ là 52,30% (Bảng 3.4). Trong khi đó, thử nghiệm Carba NP cải tiến có độ nhạy và độ đặc hiệu cao với các chủng A. baumanni (91,78%). Tỉ lệ sinh carbapenemase của các chủng E. coli và K. pneumoniae lần lượt là 97,44% và 85,23%. Bảng 3.4: Kết quả thử nghiệm khả năng sinh carbapenemase của các chủng kháng bằng phương pháp THT và CarbaNP cải tiến. 10
Do độ nhạy và độ đặc hiệu của 2 phương pháp với các chủng và các gen carbapenemase khác nhau là khác nhau nên tổng hợp kết quả của cả 2 phương pháp có 100% (39/39) chủng E. coli, >90% chủng K. pneumoniae và A. baumannii mang gen có khả năng sinh carbapenemase. Các bệnh viện ở Việt Nam hiện nay vẫn chưa áp dụng 2 kỹ thuật này để phát hiện và kiểm soát sự lây lan của các chủng vi khuẩn kháng sinh carbapenemase như khuyến cáo của CLSI. Từ kết quả của nghiên cứu này cho thấy Carba NP cải tiến có độ nhạy cao với cả 3 loại vi khuẩn, thời gian thực hiện ngắn (khoảng 2 giờ), thao tác thực hiện đơn giản và giá thành hợp lý nên việc đưa Carba NP cải tiến vào áp dụng tại các bệnh viện Việt Nam để sàng lọc và phát hiện nhanh các chủng sinh carbapenemase là hoàn toàn khả thi và cần thiết, đặc biệt là khi nhận thức được tầm quan trọng của việc phát hiện sớm các chủng sinh carbapenemase đối với các nỗ lực tăng cường hiệu quả cho công tác điều trị và kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện. 3.3.2. Xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn mang gen kháng theo tiêu chuẩn lâm sàng Kết quả MIC cho thấy tỷ lệ vi khuẩn kháng lại IMP và MEM theo tiêu chuẩn lâm sàng đều ở mức cao, cao nhất là ở A. baumannii (85,56% và 90%), thấp nhất là ở E. coli (76,92% và 69,23%). Trong đó nhiều chủng kháng lại kháng sinh nhóm carbapenem ở nồng độ cao 32-256 µg/ml. Mức độ đề kháng của các chủng vi khuẩn với các kháng sinh khác như CIP, CAZ rất cao, trong đó cao nhất là CTX với tỉ lệ các chủng E. coli, K. pneumoniae và A. baumannii kháng lần lượt là 94,87%, 96,3% và 96,67%. Sự có mặt rất phổ biến của các gen sinh ESBL như TEM, SHV, CTX trong các chủng kháng là cơ sở giải thích cho mức độ đề kháng cao với các kháng sinh này. Đa số các chủng 11
kháng (> 90%) vẫn nhạy với colistin. Nếu các chủng đã kháng các kháng sinh thông thường và nhóm carbapenem lại kháng cả colistin sẽ dẫn đến nguy cơ không còn thuốc kháng sinh có tác dụng điều trị. Đáng lưu ý là trong tổng số 431 chủng có 11 chủng kháng với cả 6 loại kháng sinh, chiếm 2,55%. Với tốc độ gia tăng nhanh chóng của tỉ lệ đề kháng carbapenem ở các vi khuẩn Gram âm trong những năm gần đây ở Việt Nam, hoàn toàn có khả năng tỉ lệ này sẽ tăng lên nhanh chóng, cảnh báo khả năng lan rộng của các chủng vi khuẩn kháng hết các loại kháng sinh dẫn đến thất bại trong điều trị. 3.4. Xác định mối liên hệ về kiểu gen của các chủng vi khuẩn mang gen carbapenemase phân lập tại Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Trung ương quân đội 108 3.4.1. Xác định mối liên hệ về kiểu gen của các chủng vi khuẩn mang gen carbapenemase bằng phương pháp PFGE Nhìn chung các chủng E. coli mang gen kháng có độ tương đồng không cao, chỉ có 2 nhóm kiểu gen có độ tương đồng ≥ 80%. Trái lại các chủng K. pneumoniae và A. baumannii có độ tương đồng cao hơn với 6 nhóm kiểu gen (Hình 3.8). Ở cả 3 loại vi khuẩn đều ghi nhận hiện tượng các nhóm kiểu gen tương đồng bao gồm các chủng thuộc cùng 1 khoa, hoặc thuộc các khoa khác nhau của 2 bệnh viện được phân lập cùng năm hoặc nhiều năm khác nhau. Đây là cơ sở để đưa ra giả thuyết về sự lây lan của các chủng mang gen kháng giữa các bệnh nhân của cùng 1 khoa; sự lưu hành của các chủng kháng qua nhiều năm tại khoa đó và khả năng lây lan giữa các khoa khác nhau. Các chủng không thuộc một nhóm kiểu gen do độ tương đồng thấp nên không cùng nguồn gốc và có thể hình thành một cách riêng lẻ dưới 12
áp lực của chọn lọc tự nhiên hoặc lây nhiễm từ môi trường bên ngoài bệnh viện. Hình 3.8: Mối liên hệ về kiểu gen giữa các chủng A. baumannii mang gen kháng mã hóa carbapenemase phân lập từ 2 bệnh viện. 3.4.2. Xác định mối liên hệ về kiểu gen và sequence type của các chủng vi khuẩn mang gen carbapenemase tại Việt Nam và trên thế giới bằng phương pháp WGS 3.4.2.1. Mối liên hệ về kiểu gen và sequence type của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen carbapenemase tại Việt Nam và trên thế giới Kết quả phân tích mối liên hệ về kiểu gen của các chủng vi khuẩn mang gen carbapenemase phân lập tại 2 bệnh viện tương đồng với kết quả PFGE: có mối liên hệ chặt chẽ về kiểu gen giữa các chủng vi khuẩn được phân lập vào các năm khác nhau ở cùng 1 khoa và ở các khoa khác nhau của Bệnh viện Việt Đức. Điều này một lần nữa củng cố thêm cho giả thuyết về sự lưu hành của các chủng mang gen kháng trong nội bộ 1 khoa qua các năm cũng như sự lan truyền giữa các khoa khác nhau. 13
Từ kết quả phân tích, so sánh core genome của các chủng vi khuẩn trong nghiên cứu này với 2 bệnh viện lớn khác của Hà Nội (Hình 3.10), có thể nhận thấy hai vấn đề nổi cộm ở các bệnh viện lớn tại Hà Nội: (i) sự phát tán rộng rãi của plasmid mang gen NDM trong các chủng E. coli (gen NDM phân bố ở 10/12 ST có chủng mang gen kháng và tỉ lệ dương tính với gen NDM rất cao); (ii) kiểu kháng và nguồn gốc của các chủng kháng ở các bệnh viện có sự khác biệt cho thấy nhiều khả năng các chủng kháng hình thành do áp lực chọn lọc tự nhiên từ thói quen sử dụng kháng sinh khác nhau ở các bệnh viện hơn là bắt nguồn từ sự lây lan giữa các bệnh viện với nhau. Hình 3.10: Cây phân loại core genome và sequence type của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen carbapenemase phân lập tại 4 bệnh viện ở Hà Nội. Một chủng duy nhất của bệnh viện TƯQĐ 108 thuộc ST457, là ST gần đây được phát hiện mang gen MCR-1 kháng colistin ở Việt Nam và Trung Quốc. Nếu các chủng E. coli ST457 mang gen kháng carbapenem và colistin truyền plasmid cho nhau tạo nên thế hệ sau kháng cả 2 loại kháng sinh này trên nền đã kháng nhiều nhóm kháng sinh khác, có thể vô hiệu hoá các loại kháng sinh sử dụng trên lâm 14
sàng và gây ra những hậu quả đặc biệt nghiêm trọng cho sức khoẻ con người. So sánh ST của các chủng E. coli sinh carbapenemase được phân lập tại Việt Nam với trên thế giới (Hình 3.11) nhận thấy một số ST phổ biến ở khắp các châu lục như ST131, ST101, ST167, ST617, ST648, ST38 đều đã xuất hiện ở Việt Nam, đặc biệt là ST131 chịu trách nhiệm cho những vụ dịch nhiễm khuẩn bệnh viện lớn xảy ra trong môi trường bệnh viện. Có những ST mới chỉ được ghi nhận lần đầu tại Việt Nam như ST48, ST709, ST448, ST2930, ST3580, trong đó ST48 và ST709 đều thuộc clonal complex ST10 thường mang gen sinh ESBL ở người, động vật và môi trường, cho thấy mối nguy hiểm tiềm tàng về khả năng lây lan các chủng vi khuẩn mang gen kháng sang các vật chủ khác nhau. Hình 3.11: Biểu đồ mối liên hệ và phân bố sequence type của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen carbapenemase trên thế giới. 15
3.4.2.2. Mối liên hệ về kiểu gen và sequence type của các chủng vi khuẩn K. pneumoniae mang gen carbapenemase tại Việt Nam và trên thế giới Tương tự E. coli, các nhóm chủng K. pneumoniae có mối quan hệ gần gũi về kiểu gen đều thuộc 1 ST hoặc các ST cùng một clonal complex (Hình 3.12). Các chủng mang gen kháng phân bố vào 11 ST khác nhau trong đó chiếm ưu thế là ST11 và ST15, các nhóm ST gây ra những vụ dịch lớn trên thế giới. Hình 3.12: Cây phân loại core genome và sequence type của các chủng vi khuẩn K. pneumoniae mang gen carbapenemase phân lập tại 2 bệnh viện. Cả 3 gen KPC, NDM và OXA-48 đều xuất hiện ở các chủng thuộc ST11. Việc các chủng thuộc cùng một ST mang nhiều gen carbapenemase (nằm trên plasmid) sẽ là điều kiện thuận lợi để tạo ra những chủng mang đồng thời nhiều gen kháng khác nhau thông qua 16
các phương thức truyền gen ngang, ví dụ đã ghi nhận 01 chủng K. pneumoniae ST11 mang 2 gen NDM-1 và OXA-181. Cũng tương tự các chủng E. coli, gen NDM phân bố rộng khắp ở 10/11 ST, trong khi KPC và OXA-48 lại có xu hướng khu trú vào một vài ST nhất định. Trong vài năm trở lại đây, một số dòng vi khuẩn kháng đang dần thay thế clonal complex ST258 gây dịch ở nhiều quốc gia trên thế giới, điển hình là ST307, dòng vi khuẩn gắn liền với sự lan rộng trên toàn thế giới của gen CTX-M-15 sinh ESBL trước khi mang gen KPC và gây ra những vụ dịch lớn ở Italy năm 2014 và gần đây là ở Hàn Quốc năm 2015. Trong nghiên cứu này có 5 chủng ST307, dù số lượng còn ít nhưng vẫn cần phải theo dõi sát sao dòng vi khuẩn này trong thời gian tới do những hậu quả nghiêm trọng mà nó gây ra như tỉ lệ tử vong cao, kéo dài thời gian điều trị so với các dòng vi khuẩn khác. Khi tổng hợp thêm dữ liệu WGS ở 2 bệnh viện Thanh Nhàn và Xanh Pôn và kết quả nghiên cứu ở bệnh viện Chợ Rẫy, Thành phố Hồ Chí Minh, nhận thấy ST15 là dòng ST nổi trội ở các bệnh viện lớn của Việt Nam. Kết quả phân tích mối liên hệ về sequence type giữa các chủng K. pneumoniae phân lập tại Việt Nam và trên thế giới (Hình 3.14) cho thấy các chủng thịnh hành trên toàn thế giới như ST15, ST11, ST307, ST395, ST231, ST37, ST16 cũng đều được ghi nhận tại Việt Nam. Đáng chú ý là không phát hiện ST258 ở Việt Nam mặc dù chủng này đã và đang gây đại dịch ở các quốc gia Châu Âu và Mỹ. Thay vào đó, sự phổ biến của ST15 và ST11 ở Việt Nam hoàn toàn tương đồng với tình hình chung ở khu vực Châu Á như Trung Quốc và Đài Loan, những quốc gia hiện coi ST11 là ST chịu trách nhiệm chính cho sự lan truyền rộng rãi và nổi trội của các chủng sinh carbapenemase. Như 17
vậy các chủng mang gen carbapenemase ở Việt Nam nhiều khả năng có cùng nguồn gốc với các chủng trong khu vực Châu Á, điển hình là Trung Quốc. Một trong những nguyên nhân dẫn đến tình trạng này là vị trí tiếp giáp và mật độ thông thương rất cao giữa Việt Nam và Trung Quốc. Hình 3.14: Cây phân loại core genome và sequence type của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen carbapenemase phân lập tại 4 bệnh viện ở Hà Nội Với những phát hiện tương đồng về sự tồn tại của các ST thịnh hành trên thế giới và các ST chỉ xuất hiện ở Việt Nam ở cả 2 chủng E. coli và K. pneumoniae trong nghiên cứu này, có thể đưa đến kết luận: sự hình thành và lan truyền của các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh được phân lập tại các bệnh viện của Việt Nam thông qua 2 con đường chính: (i) sự lan truyền các chủng mang gen kháng từ các quốc gia trong khu vực và trên thế giới; (ii) là sự hình thành do áp lực chọn lọc tự nhiên, hậu quả của việc sử dụng kháng sinh trong điều trị trong khoảng thời gian dài và liên tục. Dù là theo con đường nào đều thấy 18