Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học: Đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase và tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết cây Bơ (Persea americana Mill.)

Chia sẻ: Chuheo Dethuong25 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:55

Thêm vào BST

Báo xấu

33
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Khóa luận được nghiên cứu với mục tiêu nhằm sàng lọc tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của các bộ phận cây Bơ (Persea americana Mill.). Đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết của bộ phận có tác dụng mạnh nhất.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học: Đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase và tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết cây Bơ (Persea americana Mill.)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC HOÀNG THỊ THÚY ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM ACETYLCHOLINESTERASE VÀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT CÂY BƠ (Persea americana Mill.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2019
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y- DƯỢC U VN y, ac rm ha dP HOÀNG THỊ THÚY ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM an ine ACETYLCHOLINESTERASE VÀ TÁC DỤNG ic CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT CÂY BƠ ed M (Persea americana Mill.) of KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC ol ho (NGÀNH DƯỢC HỌC) Sc @ Khóa: QH.2014.Y ht Người hướng dẫn 1: ThS. ĐẶNG KIM THU rig Người hướng dẫn 2: PGS.TS BÙI THANH TÙNG py Co HÀ NỘI – 2019 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
LỜI CẢM ƠN U Với mỗi sinh viên khóa luận là món quà cuối cùng để lại dưới mái trường VN thân yêu trước khi rời xa. Và tôi cũng thế, với tôi khóa luận không chỉ là món quà mà còn là hành trang tiếp bước cho tôi trên con đường sắp tới. Mỗi ngày thực nghiệm, mỗi ngày hoàn thành khóa luận tôi đã gặp muôn vàn khó khăn nhưng thật y, may mắn khi tôi nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu từ thầy cô, bạn bè và ac những người thân yêu để tôi hoàn thành món quà này một cách tốt nhất. rm Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn hai thầy cô đã hướng dẫn tôi trong khóa luận này là ThS. Đặng Kim Thu và PGS.TS Bùi Thanh Tùng – Bộ môn Dược ha lý – Dược lâm sàng khoa Y Dược. Các thầy cô luôn quan tâm, tận tình chỉ bảo dP những kĩ năng, kiến thức không chỉ trong khóa luận này mà còn định hướng cho tôi trên con đường tương lai sắp tới, giúp tôi vững tin trên con đường phía trước. an Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Y Dược đã trang bị cho tôi đầy đủ cơ sở vật ine chất và cho phép tôi thực hiện khóa luận này. Đồng thời trong quá trình thực hiện tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo phụ trách các bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, ic Hóa dược – Kiểm nghiệm, Bào chế, Dược cổ truyền đã hết lòng giúp đỡ và tạo điều ed kiện cho tôi được sử dụng các dụng cụ, phòng thí nghiệm và cho tôi nhiều bài học quý giá trong nghiên cứu khoa học. M Cuối cùng, với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn đặc of biệt nhất tới bố mẹ, người thân và bạn bè của tôi – những người luôn bên tôi, giúp đỡ, chia sẻ và đồng hành cùng tôi để vượt qua mọi khó khăn không chỉ trong khóa ol luận này mà trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và cuộc sống của tôi. ho Tôi xin chân thành cảm ơn! Sc Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2019 @ Sinh viên ht rig Hoàng Thị Thúy py Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT U A Độ hấp thụ (Absorbance) VN ACh Acetylcholin y, AChE Acetylcholinesterase ac ATCI Acetylthiocholin iodid rm DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl ha DTNB Acid 5-5’-dithiobis-2-nitrobenzoic dP EtOAc Ethylacetate EtOH Ethanol an ine FDA Hiệp hội Quản lý Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ ic IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%) ed IU Đơn vị quốc tế (Interational Unit) M n-BuOH n-buthanol of Ph Chỉ số hoạt động của ion hidro (Hydrogen power) ol ho SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) Sc ⃐ 𝐗 Giá trị trung bình @ ht rig py Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1. Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp Acetylcholin ...............................................5 U Hình 1.2. Các vị trí hoạt động của Enzym AChE .......................................................5 VN Hình 1.3. Quả Bơ (Persea americana Mill) .............................................................13 Hình 1.4. Công thức cấu tạo một số chất trong quả Bơ ............................................17 y, ac Hình 2.1. Nguyên liệu chiết xuất ..............................................................................20 Hình 2.2. Sơ đồ phản ứng tạo màu trong phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử rm Ellman ...............................................................................................................24 ha Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn hạt quả Bơ .....................................................28 dP Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của lá và các phần trong quả Bơ ..........................................................................................................................29 an Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của acid ascorbic ....................29 ine Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym AChE của lá và các phần trong quả Bơ ...............................................................................................................31 ic Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym AChE của Donezepil ...............31 ed Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của các phân đoạn hạt quả Bơ 33 M Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym AChE của các phân đoạn dịch of chiết hạt quả Bơ ................................................................................................34 Hình 3.8. Đồ thị Lineweaver – Burk cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH hạt quả Bơ ol ..........................................................................................................................35 ho Hình 3.9. Đồ thị Dixon cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH hạt quả Bơ để xác định Sc hằng số ức chế Ki .............................................................................................36 @ ht rig py Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các chất chống oxy hóa nội sinh ................................................................8 U Bảng 1.2. Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa..................................9 VN Bảng 1.3. Đặc điểm phân biệt ba giống Bơ ..............................................................14 Bảng 1.4. Thành phần quả Bơ ...................................................................................15 y, ac Bảng 1.5. Thành phần dinh dưỡng chính của 100g thịt Bơ tươi (USDA) ................16 Bảng 2.1. Thành phần của hỗn hợp phản ứng ...........................................................24 rm Bảng 3.1. Giá trị IC50 của lá Bơ, các phần trong quả Bơ và acid ascorbic về khả ha năng quét gốc tự do DPPH ...............................................................................30 dP Bảng 3.2. Giá trị IC50 của lá Bơ, các phần trong quả Bơ và chất chuẩn Donezepil về khả năng ức chế enzym AChE .........................................................................32 an Bảng 3.3. Giá trị IC50 các phân đoạn từ hạt quả Bơ và acid ascorbic về khả năng ine quét gốc tự do DPPH ........................................................................................33 Bảng 3.4. Giá trị IC50 của các phân đoạn dịch chiết từ hạt quả Bơ và chất chuẩn ic Donezepil về khả năng ức chế enzym AChE ...................................................34 ed M of ol ho Sc @ ht rig py Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN U DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VN DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ DANH MỤC BẢNG y, MỞ ĐẦU.............................................................................................................................. 1 ac CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN............................................................................................ 3 rm 1.1. Tổng quan về bệnh Alzheimer ..........................................................................3 ha 1.1.1. Bệnh Alzheimer ................................................................................................3 dP 1.1.2. Enzym AChE và các chất ức chế enzym AChE ...............................................4 an 1.1.3. Quá trình oxy hóa trong cơ thể và các chất chống oxy hóa ..............................6 1.2. Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa và tác dụng ức chế ine enzym AChE in vitro. ................................................................................................9 ic 1.2.1. Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro ............................9 ed 1.2.2. Các phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro .........................................................................11 M 1.3. Tổng quan về Bơ...............................................................................................13 of 1.3.1. Nguồn gốc, phân boại .....................................................................................13 ol 1.3.2. Đặc điểm thực vật ...........................................................................................15 ho 1.3.3. Thành phần hóa học ........................................................................................15 Sc 1.3.4. Tác dụng và công dụng ...................................................................................18 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................... 20 @ 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ...............................................................................20 ht 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................20 rig 2.1.2. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu ...............................................................................20 py 2.1.3. Hóa chất, dung môi .........................................................................................20 Co 2.1.4. Thiết bị, dụng cụ .............................................................................................21 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................21 2.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................22 U 2.3.1. Phương pháp chiết xuất ...................................................................................22 VN 2.3.2. Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa .............................................22 2.3.3. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE ....................................23 y, ac 2.3.4. Phương pháp đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym AChE ...................26 2.4. Phương pháp xử lí số liệu ................................................................................27 rm CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ ................................................................................................ 28 ha 3.1. Chiết xuất và phân đoạn dịch chiết ................................................................28 dP 3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính cao chiết lá và các phần trong quả Bơ .............29 an 3.2.1. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa theo phương pháp DPPH .............29 3.2.2. Kết quả đánh giá khả năng ức chế enzym AChE ............................................30 ine 3.3. Kết quả đánh giá hoạt tính cao chiết phân đoạn hạt quả Bơ .......................32 ic 3.3.1. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa theo phương pháp DPPH .............32 ed 3.3.2. Kết quả đánh giá khả năng ức chế enzym AChE ............................................34 M 3.3.3. Kết quả xác định động học ức chế enzym AChE ...........................................35 of CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN .............................................................................................. 37 4.1. Về kết quả sàng lọc tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của ol dịch chiết lá và quả Bơ ............................................................................................37 ho 4.2. Về kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của Sc các phân đoạn dịch chiết của bộ phận có tác dụng mạnh nhất ..........................38 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................. 41 @ ht TÀI LIỆU THAM KHẢO rig py Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
MỞ ĐẦU Bệnh Alzheimer là một bệnh thoái hóa thần kinh tiến triển liên quan đến tuổi, U làm suy yếu khả năng nhớ và nhận thức [34]. Theo Tổ chức Y tế Thế giới năm VN 2017, 44 triệu người trên thế giới bị mất trí nhớ và trong đó chiếm tới 60-70% là bệnh nhân Alzheimer [23]. Bệnh lý học của Alzheimer hiện vẫn chưa được làm y, sáng tỏ và hiện nay các nhà khoa học cho rằng ở các bệnh nhân Alzheimer có sự kết ac hợp của các yếu tố di truyền và môi trường gây ra. Vì thế việc hiểu biết về cơ chế bệnh vẫn cần được làm sáng rõ và sẽ là chìa khóa để phát triển thuốc điều trị bệnh. rm Các nghiên cứu cho thấy sự thiếu hụt trong các chất dẫn truyền thần kinh gây ha ra suy giảm nhận thức và mất trí nhớ ở bệnh nhân Alzheimer [55]. dP Acetylcholinesterase (AChE) là một enzym có tác dụng thủy phân chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine. Một số phương pháp điều trị khác nhau có mục tiêu tăng an cường dẫn truyền cholinergic bằng cách tăng lượng tiền chất ACh, ngăn chặn quá trình thủy phân bởi chất ức chế AChE, kích thích các thụ thể nicotinic và ine muscarinic hoặc sử dụng các chất có tác dụng tương tự cholinergic [61]. Bởi vậy, các chất ức chế enzym AChE đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị bệnh ic Alzheimer. Mặt khác, sự gia tăng quá mức của các gốc tự do trong cơ thể gây ra ed hiện tượng “stress oxy hóa” được cho là một trong những nguyên nhân gây ra các bệnh mạn tính và thoái hóa như bệnh Alzheimer và Parkinson. Tuy nhiên các chất M ức chế enzym AChE như physostigmine, galantamine, tacrine, donepezil, of metrifonate,... lại không mang lại hiệu quả cao và gây ra nhiều tác dụng không mong muốn như: buồn nôn, nôn, đau bụng tiêu chảy, khó tiêu, phát ban.... [44]. ol Physostigmin là chất ức chế AChE đầu tiên được dùng cho nghiên cứu điều trị bệnh ho Alzheimer, nhưng đã bị thu hồi khỏi thị trường do một số tác dụng không mong muốn. Tacrine cũng gây độc đối với gan trong các thử nghiệm lâm sàng [62]. Ngoài Sc ra, các thuốc thuộc nhóm chống oxy hóa như vitamin E, Ginkgo biloba… được sử dụng để điều trị những tổn thương liên quan đến nhận thức ở bệnh nhân Alzheimer @ có nguồn gốc từ tự nhiên. Vì vậy, việc nghiên cứu các dược liệu vừa có hoạt tính ht chống oxy hóa vừa có khả năng ức chế enzym AChE để phòng và điều trị bệnh rig Alzeimer là hướng nghiên cứu thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới. py Bơ có tên khoa học là Persea americana Mill (Lauraceae), là một loại cây Co cận nhiệt đới có nguồn gốc từ Mexico và Trung Mỹ. Nghiên cứu cho thấy trong Bơ có chứa các hợp chất peptone, b-galactoside, acid glycosylated abscisic, alkaloids, 1 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
cellulose, polygalacto urease, polyuronoids, cytochrome P450,…[48, 64]. Bơ cũng đã được sử dụng cho điều trị một số bệnh như lở loét, tăng huyết áp, đau bụng, U viêm phế quản [15], tiêu chảy và tiểu đường [22]. Ngoài ra, Bơ có hàm lượng kali VN cao và ít natri, giúp điều chỉnh cân bằng điện giải và áp lực máu trong cơ thể, giúp ổn định huyết áp [32]. Các hợp chất béo omega-3, carotenoid và vitamin làm cho quả Bơ có tác dụng chống viêm [15]. Lá Bơ có tác dụng hạ glucose huyết và hạ y, cholesterol toàn phần và LDL, có tác dụng phòng ngừa xơ vữa động mạch [28]. ac Hơn nữa, lá Bơ còn có tác dụng trên hệ thần kinh như chống co giật [53], ức chế rm enzym AChE và butyrylcholinesterase và tác dụng chống oxy hóa [51]. Tác dụng ngăn ngừa và điều trị bệnh của dược liệu ngày càng thu hút sự chú ha ý của các nhà nghiên cứu để tìm ra sản phẩm tự nhiên tiềm năng dùng làm thuốc để dP chống lại bệnh Alzheimer. Tuy nhiên, qua tìm hiểu thì tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về đánh giá tác dụng ức chế AChE và chống oxy hóa DPPH của lá và quả an Bơ trồng tại Việt Nam để có thể định hướng phát triển thành các sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer. Vì vậy, chúng tôi đề xuất tiến hành đề tài: “Đánh giá tác ine dụng ức chế enzym acetylcholinesterase và tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết cây Bơ (Persea americana Mill.)” với mục tiêu: ic Mục tiêu 1: Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của ed các bộ phận cây Bơ (Persea americana Mill.). M Mục tiêu 2: Đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của of các phân đoạn dịch chiết của bộ phận có tác dụng mạnh nhất. ol ho Sc @ ht rig py Co 2 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN U 1.1. Tổng quan về bệnh Alzheimer 1.1.1. Bệnh Alzheimer VN Alzheimer là bệnh thần kinh thoái hóa tiến triển, làm mất trí nhớ và giảm khả năng nhận thức, là một vấn đề đáng lo ngại, đặc biệt ở những người cao tuổi. Bệnh y, đã được mô tả đặc điểm lâm sàng lần đầu tiên tại Đức vào ngày 03 tháng 11 năm ac 1906 bởi ông Alois Alzheimer. Năm 1910, Kraepelin đã lấy tên ông đặt cho tên bệnh – bệnh Alzeimer trong tái bản lần thứ 8 bài viết Tâm thần học (Psychiatrie) rm của mình [60]. ha Bệnh Alzheimer là nguyên nhân phổ biến nhất của chứng mất trí nhớ ở hầu dP hết các quốc gia. Tỷ lệ mắc bệnh Alzeimer tăng dần theo tuổi, 96% là từ 65 tuổi trở lên. Chi phí cho việc chăm sóc và điều trị ở nước Mỹ ước tính 200 tỷ USD mỗi năm an cho căn bệnh này [26]. Việt Nam có khoảng hơn 9 triệu người bị sa sút trí tuệ với dạng bệnh điển hình là Alzeimer [6]. ine Các yếu tố nguy cơ mắc bệnh bao gồm cả yếu tố di truyền và yếu tố không di truyền. Yếu tố di truyền được thấy ở 5% các bệnh nhân mắc bệnh được nghiên cứu ic là những đột biến liên quan đến thay thế một nucleotide trong chuỗi ADN (đa hình ed nucleotide đơn) (tại nhiễm sắc thể 1, 14 hoặc 21) và các biến thể ε4 (alen) của gen M mã hóa apolipoprotein E (APOE), nằm trên nhiễm sắc thể 19 [43]. Các yếu tố nguy cơ không di truyền được đưa ra là: tuổi, giới tính. Tuổi là yếu tố nguy cơ quan trọng of nhất đối với bệnh Alzeimer khi các nghiên cứu chỉ ra rằng người trên 60 tuổi sẽ có tỷ lệ mắc bệnh tăng gấp đôi cứ sau 5-6 năm: ở nhóm tuổi 65-69 số người bị bệnh là ol 2%; ở nhóm tuổi 80-85 số người bị bệnh là 30-40%. Các nghiên cứu cũng cho thấy ho giới tính là một yếu tố nguy cơ quan trọng khi tỷ lệ mắc bệnh của phụ nữ cao hơn Sc khoảng 1,5 – 2 lần so với nam giới [25]. Bệnh Alzheimer có đặc điểm là tiến triển chậm và bắt đầu rất từ từ nên bệnh @ nhân thường khó phát hiện bệnh ở giai đoạn khởi phát. Bệnh cảnh lâm sàng là hội chứng sa sút trí tuệ điển hình và tiến triển theo 3 giai đoạn chính: ht • Giai đoạn 1: Thường kéo dài 2 – 3 năm, được đặc trưng bởi các triệu rig chứng: suy giảm trí nhớ, giảm hiệu suất trong giải quyết các công việc py thường ngày, rối loạn định hướng không gian. • Giai đoạn 2: Suy giảm trí tuệ diễn ra nhanh chóng, rõ rệt. Nhân cách của Co người bệnh cũng bắt đầu có những biến đổi. Thường gặp các triệu chứng: rối loạn ngôn ngữ, rối loạn tri giác, rối loạn hành vi, thay đổi tính cách. 3 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
• Giai đoạn 3: Giai đoạn cuối cùng. Bệnh nhân có thể nằm liệt giường, rối loạn đại tiểu tiện, các triệu chứng loạn thần (hoang tưởng, ảo giác…) U thường xuất hiện rõ rệt trong bệnh cảnh lâm sàng. Bệnh nhân không thể giao tiếp và nhận diện khuôn mặt, không thể tự chăm sóc bản thân. VN Cho tới thời điểm hiện tại, vẫn chưa có loại thuốc nào có thể chữa khỏi bệnh Alzheimer mà chỉ có thể giúp làm chậm tiến triển của bệnh và làm giảm một số y, triệu chứng. Tất cả các bệnh nhân mắc Alzheimer cần được ổn định cân bằng ac chuyển hóa và cân bằng thể dịch, đồng thời duy trì trọng lượng cơ thể ở mức bình rm thường, điều chỉnh huyết áp, mỡ máu cũng như các vấn đề khác gây khó chịu cho người bệnh. Ngoài ra cần áp dụng các biện pháp chăm sóc y tế cơ bản tùy theo mức ha độ nặng nề, suy giảm trí nhớ của người bệnh và các triệu chứng xuất hiện về sau. dP Dược liệu có khả năng phòng ngừa và điều trị một số bệnh, trong đó có bệnh Alzheimer [40]. Có rất nhiều nghiên cứu đã đánh giá hiệu quả của dịch chiết toàn an phần với tác dụng chống lại Alzheimer và tiến hành phân lập các hợp chất có tác dụng bảo vệ hiệu quả [21]. Các nghiên cứu hóa thực vật chỉ ra nhiều hợp chất có giá ine trị bao gồm lignans, flavonoid, tannin, polyphenol, triterpenes, sterol và ankaloid với một phổ rộng các tác dụng dược lý như kháng viêm, chống amyloidogenic, ic kháng cholinesterase, hạ lipid, chống oxy hóa, chống chết rụng tế bào [40]. ed 1.1.2. Enzym AChE và các chất ức chế enzym AChE M Acetylcholin (ACh) là chất trung gian hóa học có mặt trong phần lớn các khe of synap thần kinh trung ương, thần kinh thực vật, thần kinh-cơ. ACh tìm thấy ở hành não, cầu não, thân não, não trung gian, thể vân và vỏ não mới (nhiều nhất ở vùng ol vận động). Trong tủy sống, các hạch thần kinh thực vật, các tận cùng thần kinh tiếp ho xúc với cơ quan ngoại vi đều chứa ACh. Trong các nghiên cứu cho thấy ACh có liên quan đến sự tiến triển của bệnh viêm dây thần kinh và quá trình sản sinh sợi Sc amyloid, những đặc điểm điển hình được thấy trong tế bào não của bệnh nhân mắc Alzheimer [56]. @ Acetylcholin được tổng hợp từ cholin và acetyl Coenzym A do enzym cholin ht acetyl transferase xúc tác phản ứng, sau đó, được lưu giữ ở vị trí cuối dây thần kinh, rig trong các túi. Các chất trong túi được giải phóng khi vị trí cuối dây thần kinh bị khử cực và khi đó ACh được giải phóng vào khe synap và gắn với thụ thể. ACh sau khi py được giải phóng có thời gian bán thải rất ngắn vì sự có mặt của enzym AChE. Đây Co là enzym thủy phân dây nối este trong phân tử ACh tạo ra cholin và acid acetic. Cholin sau đó được thu nhận lại vào tế bào thần kinh để tổng hợp ACh. Do đó, 4 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
những chất có tác dụng ức chế AChE sẽ kéo dài thời gian tồn tại và thời gian tác dụng của ACh [8, 20]. U VN y, ac rm ha dP an Hình 1.1. Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp Acetylcholin ine AChE, với vai trò thủy phân ACh, là một protein có hình elip chứa một rãnh sâu, được gọi là hẻm. Quá trình thủy phân ACh được xúc tác bởi AChE diễn ra ở ic đáy của hẻm enzym theo cơ chế khá phức tạp. Ở đáy của hẻm, nơi xảy ra sự thủy ed phân cơ chất ACh, có 4 vị trí hoạt động chính (hình 1.2) là vị trí este hóa, vị trí oxy- anion, vị trí anion và túi acyl [39]. M of ol ho Sc @ ht rig py Hình 1.2. Các vị trí hoạt động của Enzym AChE Co 5 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
AChE là một trong những enzym thủy phân nhanh nhất. Hoạt tính của nó mạnh gấp khoảng 10 lần so với serin protease hoặc butyrylcholinesterase (enzym U thủy phân ACh chủ yếu ở tế bào thần kinh đệm) ở cùng điều kiện nhiệt độ và pH VN [36]. Theo giả thuyết cholinergic, các chất đối kháng cholinergic gây ra suy giảm trí nhớ và khả năng nhận thức của con người còn các chất đối kháng muscarinic thì y, có tác dụng ngược lại [65]. Do vậy, việc ức chế AChE sẽ duy trì nồng độ và thời ac gian hoạt động của ACh tại các khe synap, từ đó có tác dụng duy trì khả năng ghi rm nhớ và khả năng học tập của con người [58]. Sự giảm sút nồng độ ACh thường gặp ở các bệnh nhân Alzheimer, theo nghiên cứu của tác giả Di Giovanni S. và cộng sự, ha trong não của bệnh nhân Alzheimer có sự thiếu hụt đến gần 90% lượng chất dẫn dP truyền thần kinh này [33]. Trong khi nguyên nhân gây bệnh còn chưa được các nhà khoa học làm rõ thì các chất ức chế AChE là lựa chọn hàng đầu cho các bệnh nhân an Alzheimer, thông qua việc duy trì nồng độ ACh trong não, các chất này có tác dụng làm giảm các triệu chứng và ngăn chặn sự tiến triển của bệnh [49]. ine AChE chủ yếu có mặt trong hệ thần kinh trung ương, xúc tác thủy phân chất ic dẫn truyền ACh. Ở bệnh nhân Alzheimer thấy có sự giảm trầm trọng nồng độ chất dẫn truyền thần kinh ACh. Tình trạng này gây suy giảm khả năng nhận thức đối với ed người bệnh. Giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic trong bệnh Alzheimer được M đưa ra lần đầu tiên vào năm 1982 bởi tác giả Whitehouse và cộng sự. Sau đó, giả thuyết này nhanh chóng trở thành động lực cho quá trình nghiên cứu theo hướng cải of thiện chức năng hệ cholinergic trên bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer. Theo giả ol thuyết này, những chất ức chế sự hoạt động của AChE làm tăng nồng độ và thời gian hoạt động của ACh ở synap thần kinh từ đó cải thiện triệu chứng bệnh [31, 56]. ho 1.1.3. Quá trình oxy hóa trong cơ thể và các chất chống oxy hóa Sc Quá trình oxy hóa trong cơ thể @ Oxy hóa là quá trình xảy ra phản ứng hóa học, trong đó các electron được chuyển sang chất oxy hóa hình thành nên gốc tự do. Sự gia tăng các gốc tự do trong ht cơ thể sinh ra các phản ứng dây chuyền phá hủy tế bào. rig Các gốc tự do là nguyên tử, phân tử hoặc ion với electron chưa ghép cặp rất py không ổn định và phản ứng hóa học với các phân tử khác. Các dạng hoạt động của gốc tự do ROS, RNS, RSS [1, 9, 29]. Bản chất của các gốc tự do là có khả năng Co 6 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
phản ứng cao, thời gian tồn tại ngắn phụ thuộc vào bản chất và điều kiện của hệ mà nó tồn tại [13, 29]. Cơ chế hình thành các gốc tự do trong cơ thể: U • Từ chuỗi hô hấp tế bào trong ty thể. VN • Từ quá trình peroxyd hóa lipid. • Từ phản ứng tạo gốc khác trong cơ thể. y, Đích phân tử chính của các gốc tự do là các protein, ADN (acid ac deoxyribonucleic), ARN (acid ribonucleic), đường và lipid. Những phản ứng của gốc tự do có liên quan đến nhiều bệnh nghiêm trọng như ung thư, tim mạch, béo rm phì, bệnh Alzheimer, Parkinson, lupus ban đỏ, loét dạ dày,… [29, 37]. ha Các cơ chế chống oxy hóa [42]: dP 1) Ức chế các enzym xúc tác làm tăng sản xuất các ROS/ RNS. 2) Tác động vào đường truyền tín hiệu oxy hóa khử, thúc đẩy quá trình chống an oxy hóa của tế bào. 3) Phản ứng trực tiếp với ROS/ RNS tạo ra các chất ít độc hoặc mất hoạt tính. ine Stress oxy hóa là sự mất cân bằng giữa chất oxy hóa và chất chống oxy hóa dẫn đến sự gián đoạn tín hiệu và kiểm soát oxy hóa khử gây ra nhiều thiệt hại cho ic các phân tử sinh học [79]. Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng stress oxy hóa ed đóng một vai trò quan trọng trong sinh lý bệnh Alzheimer [69]. Một số chất chống M oxy hóa như N-acetylcystein, curcumin, resveratrol, vitamin E, acid ferulic, selen, coenzym Q (CoQ) và melatonin đã được thử nghiệm về khả năng cải thiện hiệu suất of nhận thức ở những người mắc bệnh Alzheimer [70]. Vì vậy những chất có khả năng ol cân bằng chất oxy hóa và chất chống oxy hóa sẽ là chất tiềm năng trong quá trình chẩn đoán và điều trị bệnh Alzheimer. ho Các chất chống oxy hóa Sc ❖ Các chất chống oxy hóa nội sinh Các chất chống oxy hóa trong cơ thể người được chia thành 2 loại, các chất @ chống oxy hóa có bản chất là enzym và các chất chống oxy hóa không phải enzym. ht Các chất chống oxy hóa có bản chất là enzym quan trọng ngăn chặn sự hình rig thành hoặc trung hòa các gốc tự do trong cơ thể là: glutathion peroxidase, catalase, superoxid dismutase, Glucose-6 phosphat dehydrogenase. Các chất chống oxy hóa py không phải enzym cũng được tổng hợp trong cơ thể nhưng rất ít, chủ yếu từ thức ăn Co bổ sung [29]. 7 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
Bảng 1.1. Các chất chống oxy hóa nội sinh U Các enzym Các chất không phải enzym VN Glutathion peroxidase Co – Enzym: Q10 Catalase Vitamin A y, Superoxide dismutase Hợp chất chứa nito (non –protein): uric ac Glucose – 6 phosphat dehydrogenase Hợp chất chứa S: Glutathion rm Mỗi chất chống oxy hóa có cơ chế tác dụng riêng với từng loại gốc tự do và ha có thể hiệp đồng với nhau để loại trừ gốc tự do. Nhờ các chất chống oxy hóa này mà quá trình oxy hóa chỉ xảy ra ở mức độ sinh lý nhất định, khi đó các dạng oxy dP hóa hoạt động thực hiện được chức năng sinh lý và duy trì được cân bằng trao đổi an chất. Việc tìm kiếm các hợp chất chống oxy hóa mới có thể tạo ra sự kết hợp hiệu quả trong điều trị một số bệnh có liên quan đến quá trình oxy hóa trong cơ thể. ine ❖ Chất chống oxy hóa trong hóa dược Thuốc chống viêm: Theo nghiên cứu, nhóm thuốc này được xếp thành 3 nhóm: ic • Nhóm 1: Những chất làm giảm gốc O2●, ●OH, H2O2 như aspirin, ed indomethacin, ibubrofen… M • Nhóm 2: Những chất làm giảm ●OH nhưng làm giảm mạnh O2●, H2O2 như hydrocortisol, 2 -3 hydroxybenzoic… of • Nhóm 3: Thuốc làm giảm ●OH ở nồng độ rất thấp như phenylbutanol. ol Các chất chống oxy hóa tổng hợp ho BHA (butylated hydroxyanisole), BHT (butylated hydroxytoluene), PG (propyl gallate), OG (octyl gallate), TBHQ (tert – butylhydroquinon)… Sc ❖ Các chất chống oxy hóa có nguồn gốc thực vật @ Trong thế giới thực vật có rất nhiều chất có tác dụng chống oxy hóa thuộc nhiều nhóm khác nhau. Đáng chú ý nhất là các vitamin và dẫn xuất của phenol: ht - Vitamin E: Ức chế phản ứng oxy hóa lipid, bảo vệ tế bào và các phần tử rig chức năng khỏi sự oxy hóa quá mức nhờ đó có tác dụng chống lão hóa, kéo dài tuổi thọ. py - Vitamin C: Là chất cho điện tử, có khả năng loại bỏ những gốc tự do ở pha Co nước của tế bào, có khả năng tái tạo Vitamin E dạng oxy hóa về dạng khử [30]. 8 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- Flavonoid: Là một nhóm các phenolic thực vật có tác dụng chống oxy hóa và tạo phức chelat rất đáng chú ý. Chúng tập trung nhiều nhất trong trái cây, rau U quả, rượu, trà và cacao. Flavonoid tồn tại trong thực phẩm dưới dạng glycoside và polymer, được thoái hóa ở nhiều mức độ trong đường tiêu hóa. VN Xu hướng ức chế quá trình trung gian tạo gốc tự do của một số flavonoid bị chi phối bởi cấu trúc hóa học của nó (cấu trúc nhân flavan, số lượng và vị trí y, các nhóm thế). Một số flavonoid có hoạt tính chống oxy hóa cao EGCG từ chè xanh, Genistein trong đậu nành, quercetin, resveratrol [38]. ac - Xanthan: Là một hợp chất phenol thực vật có hoạt tính chống oxy hóa, có rm mặt trong một số thực vật nhiệt đới. Ngoài ra còn có nhiều dẫn chất khác thuộc nhóm các phenolic tự nhiên cũng ha có tác dụng chống oxy hóa như carotenoid, acid phenolic, lignin, … dP 1.2. Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa và tác dụng ức chế enzym AChE in vitro. an 1.2.1. Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro Đánh giá khả năng chống oxy hóa có rất nhiều phương pháp được chia thành ine 2 loại: phương pháp in vitro và phương pháp in vivo [18]: ic Bảng 1.2. Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa ed Các phương pháp in vitro Các phương pháp in vivo M 1. Dọn gốc tự do DPPH 1. Khả năng làm giảm sắt trong 2. Dọn gốc tự do HO huyết tương. of 3. Dọn gốc tự do nitric oxid 2. Khả năng làm giảm glutathion ol 4. Dọn gốc tự do peroxynitrite 3. Glutathion peroxidase Phương pháp định lượng ABTS Glutathion – S – Tranferase ho 5. 4. 6. Phương pháp TRAP 5. Superoxid dismutase Sc 7. Phương pháp FRAP 6. Catalase 8. Dọn gốc tự do superoxid (SOD) 7. γ– glutanyl transpeptidase @ 9. Dọn gốc tự do hydroxyl 8. Glutathion reductase 10. Phương pháp HORAC 9. Peroxid hóa lipid ht 11. Phương pháp ORAC 10. Thử nghiệm LDL rig 12. Phương pháp RP 13. Phương pháp DMPD py 14. Enzym xanthin oxidase Co 15. Phương pháp CUPRAC… 9 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
Một số thử nghiệm đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro Thử tác dụng dọn gốc tự do DPPH U Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng giữa gốc tự do DPPH (màu tím đỏ) với chất VN chống oxy hóa để tạo ra hợp chất của DPPH có màu vàng và không hấp thụ ánh sáng tử ngoại tại bước sóng 517 nm. Đo độ hấp thụ tại bước sóng 517 nm của dung y, dịch sau phản ứng để tính lượng DPPH còn lại sau phản ứng. ac Ưu điểm: Nhanh, cho kết quả khá chính xác, dễ thực hiện và không tốn kém. rm Tuy nhiên, DPPH không tồn tại trong cơ thể sống nên phép thử này chỉ mang ý nghĩa xác định khả năng loại bỏ gốc tự do của mẫu cần thử. Dùng trong sàng lọc ha các mẫu dược liệu [13, 17, 29, 47]. dP Thử tác dụng dọn gốc tự do superoxid O2● Nguyên tắc: Gốc tự do O2● được hình thành trong quá trình oxy hóa xanthin an thành acid uric được xúc tác bởi enzym xanthinoxidase. Gốc O2● tạo thành phản ứng với nitrobule tetrazolium sẽ tạo ra chất có màu xanh đậm, hấp thụ bước sóng tại ine 560 nm, đo hấp thụ quang của dung dịch phản ứng tại bước sóng này sẽ biết lượng O2● tham gia phản ứng [13, 18, 29, 50] ic ed Ưu điểm: Nhanh, dễ thực hiện, yêu cầu ít máy móc, kết quả thu được tương đối ổn định và chính xác. M Thử tác dụng dọn gốc tự do hydroxyl ●OH of Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên phản ứng đường 2 – deoxyribose của gốc ● OH. Khi hoạt động sẽ oxy hóa đường deoxyribose để tạo ra sản phẩm cuối cùng là ol MDA (maloydialdehyd). Phân tử MDA khi phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) ho ở nhiệt độ cao sẽ có màu hồng có hấp thụ ánh sáng cực đại ở bước sóng 532 nm. Đo Sc hấp thụ quang của dung dịch tại bước sóng này sẽ cho biết nồng độ MDA được tạo ra sau quá trình oxy hóa. Từ đó tính được mức độ deoxyribose bị oxy hóa và mức @ độ dọn gốc tự do ●OH của mẫu thử. Ưu điểm: Nhanh, dễ thực hiện, chi phí thấp. Tuy nhiên gốc ●OH có hoạt tính ht rất mạnh nên rất khó để đánh giá mức độ tác dụng và kết quả ít chính xác hơn các rig thử nghiệm trên [13, 18, 29, 47]. py Co 10 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
1.2.2. Các phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro U Quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới cần phải trải qua rất nhiều giai VN đoạn và một trong những giai đoạn đầu của quá trình là nghiên cứu sàng lọc. Có nhiều phương pháp được sử dụng trong giai đoạn này và phương pháp thử in vitro được áp dụng khi nó đáp ứng được một số tiêu chí như: có thể tiến hành trên nhiều y, mẫu, lượng mẫu thử ít, kết quả nhanh, chi phí thấp. Các nhà khoa học trong và ac ngoài nước đã tiến hành nhiều phương pháp thử nghiệm để xác định hoạt tính của rm enzym AChE, bao gồm: phương pháp đo quang, phương pháp điện di, phương pháp huỳnh quang với cơ chất phát huỳnh quang, phương pháp sử dụng thang pH hay xác ha định hoạt độ điện hóa của enzym AChE. Đối với nghiên cứu tác dụng ức chế enzym AChE in vitro, có 2 phương pháp thường được sử dụng là phương pháp sử dụng dP thuốc thử Ellman và phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B. an 1.2.2.1. Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman được xây dựng và ứng dụng sớm ine nhất trong số những phương pháp được sử dụng đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro. Hiện nay, phương pháp này vẫn được sử dụng khá phổ biến ở nhiều nghiên ic cứu cùng hướng, trong đó, phương pháp đo quang được sử dụng nhiều hơn phương ed pháp sắc ký lớp mỏng sinh học. Phương pháp này sử dụng cơ chất là M acetylthiocholin iodid (ATCI) và thuốc thử là 5,5’ - dithiobis - nitrobenzoic acid (DTNB). of ❖ Phương pháp đo quang ol Phương pháp của Ellman dùng để xác định hoạt tính của enzym AChE dựa ho vào đo quang được tác giả này mô tả lần đầu tiên vào năm 1961 [45]. Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất ATCI bị thủy phân nhờ xúc tác của cholinesterase tạo Sc thiocholin. Thiocholin phản ứng với thuốc thử DTNB giải phóng ra hợp chất 5-thio- @ 2-nitrobenzoic acid màu vàng. Hợp chất này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 412 nm. ht Sau đó, nhiều nghiên cứu sàng lọc về tác dụng ức chế AChE in vitro khác rig tiếp tục được thực hiện. Tuy nhiên, so với phương pháp gốc được công bố bởi Ellman, phương pháp được triển khai trong các nghiên cứu sau đó đều có một số py thay đổi về: nguồn gốc và hoạt độ của enzym, loại đệm sử dụng, nồng độ dung dịch Co cơ chất và thuốc thử… cũng như tỷ lệ phối hợp của chúng vào hỗn hợp phản ứng [57, 59]. 11 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
❖ Phương pháp sắc ký lớp mỏng Trên cơ sở phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman, phương pháp U sắc ký lớp mỏng sinh học đã được phát triển. Ở phương pháp này, sau khi bản mỏng VN được triển khai, hỗn hợp gồm dung dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được phun lên bản mỏng, sau đó mới phun dung dịch enzym. Những chất gây ức chế y, AChE sẽ làm xuất hiện các vết màu trắng trên nền vàng [16]. ac Một trong những hạn chế của phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học là có thể gặp phải hiện tượng dương tính giả, hiện tượng vết màu trắng xuất hiện trên bản rm mỏng không phải do tác dụng ức chế enzym AChE. Để khắc phục hạn chế này, bên ha cạnh bản mỏng thử phải tiến hành làm thí nghiệm với một bản mỏng khác (bản đối chiếu). Các bước tiến hành trên bản đối chiếu tương tự như trên bản thử chỉ khác ở dP giai đoạn phun thuốc thử hiện màu. Đối với bản thử, hỗn hợp dung dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được phun trước, sau đó mới phun dung dịch enzym an AChE. Với bản đối chiếu, dung dịch thuốc thử DTNB được phun trước, sau đó hỗn hợp gồm dung dịch cơ chất ATCI và dung dịch enzym AChE được phun sau. Cách ine bố trí thử nghiệm như trên nhằm đảm bảo những vết màu trắng xuất hiện trên cả hai ic bản là những vết cho phản ứng dương tính giả [14]. ed 1.2.2.2. Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B So với phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman, số lượng nghiên cứu sử dụng M phương pháp này để đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro khá hạn chế. Phương of pháp này sử dụng cơ chất là α-naphthyl acetat và thuốc thử là muối Fast Blue B (muối O-dianisidin bis(diazotized) zinc double). ol ❖ Phương pháp đo quang ho Thử nghiệm đo quang sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B được công bố lần Sc đầu tiên bởi tác giả Van Asperen K. vào năm 1962 [63]. Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất α-naphthyl acetat bị thủy phân bởi enzym esterase giải phóng chất α- @ naphthol. Chất này sau đó phản ứng với thuốc thử muối Fast Blue B tạo thành sản phẩm màu diazo. Hợp chất này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của dung ht dịch ở bước sóng 600 nm. Tuy nhiên, sau đó không có nhiều nghiên cứu sử dụng rig phương pháp này để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro và một py trong số đó là nghiên cứu của tác giả Di Giovanni S. [33, 46]. Phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu của tác giả này có một số thay đổi so với phương pháp của Co 12 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma