Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học: Định lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chia sẻ: Chuheo Dethuong25 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:57

Thêm vào BST

Báo xấu

36
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Khóa luận được nghiên cứu với mục tiêu nhằm xây dựng phương pháp định lượng stipuleanosid R2 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong cao sâm vũ diệp và dược liệu sâm vũ diệp thu hái ở Tây Bắc.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học: Định lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC DƯƠNG THỊ PHƯỢNG ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG THÂN RỄ SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2018
U ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI VN KHOA Y DƯỢC y, DƯƠNG THỊ PHƯỢNG ac rm a ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG THÂN Ph RỄ SÂM VŨ DIỆP d (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG an ine HIỆU NĂNG CAO dic Me of KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC ol ho Khóa: QH.2013.Y Người hướng dẫn: TS. NGUYỄN HỮU TÙNG Sc ThS. NGUYỄN THỊ HOÀNG ANH @ ht rig py Co Hà Nội - 2018 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
LỜI CẢM ƠN U Trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận VN được rất nhiều sự giúp đỡ vô cùng quý báu của các thầy cô giáo của Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cùng với gia đình và bạn bè. Thời điểm hoàn thành khóa y, luận cũng là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình với ac những người đã dạy dỗ, hướng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn của mình là rm TS. Nguyễn Hữu Tùng - Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội - người thầy đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong quá a Ph trình thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn của mình tới ThS. Nguyễn Thị Hoàng Anh vì đã luôn dành thời gian hướng dẫn và động viên tôi trong quá trình hoàn d thiện khóa luận. an Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm Khoa, các thầy cô trong Khoa Y Dược đặc biệt là Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc đã luôn tạo điều ine kiện cho tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin cảm ơn tập thể lớp Dược học khóa QH.2013.Y, đặc biệt là các dic bạn Thùy, Phương, Chuyên đã luôn đồng hành với tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thành viên trong nhóm nghiên cứu của tôi là chị Me Thủy và chị Huệ vì đã luôn giúp đỡ và nhiệt tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. of Lời cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình đã nuôi dạy, khích lệ và sát cánh, giúp tôi có thêm động lực cố gắng để có kết quả như ngày hôm nay. ol Hà Nội, ngày 30 tháng 4 năm 2018 ho Sinh viên Sc @ Dương Thị Phượng ht rig py Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT U VN ACN Acetonitril BuOH Buthanol y, Detector mảng điốt (Diode array detector) ac DAD Dd Dung dịch rm EtOH Ethanol a HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performace liquid chromatography) Ph LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) d LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) an MeOH Methanol RSD Độ lệch chuẩn tương đối ine SKĐ Sắc ký đồ dic SKLM Sắc ký lớp mỏng Sti Stipuleanosid R2 Me SVD Sâm vũ diệp of TB Trung bình TT Thứ tự ol UV Ultra violete ho VIS Visible Sc @ ht rig py Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU U VN Bảng 1. Chương trình dung môi. 18 Bảng 2. Sự phù hợp hệ thống để xác định độ tinh khiết. y, 19 ac Bảng 3. Tính thích hợp hệ thống 23 Bảng 4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của stipuleanosid R2 24 rm Bảng 5. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp 26 a Bảng 6. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 27 Ph Bảng 7. Kết quả định lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ sâm vũ diệp 28 d an ine dic Me of ol ho Sc @ ht rig py Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ U VN Hình 1.1. Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) 2 Hình 1.2. Các hợp chất tách được từ rễ cây sâm vũ diệp y, 4 ac Hình 1.3. Công thức cấu tạo của stipuleanosid R2 5 Hình 1.4. Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng 7 rm Hình 2.1. Mẫu rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa 10 a Pa, Lào Cai vào ngày 15/7/2016 Ph Hình 2.2. Hình ảnh stipuleanosid R2 phân lập được 11 Hình 3.1. Sắc ký đồ của stipuleanosid R2 phân lập được sau khi phun d 17 an H2SO4 10% /EtOH Hình 3.2. Sắc ký đồ xác định độ tinh khiết của stipuleanosid R2 bằng HPLC 19 ine Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu trắng 21 dic Hình 3.4. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 21 Hình 3.5. Sắc ký đồ dung dịch thử 22 Me Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của stipuleanosid R2 24 of ol ho Sc @ ht rig py Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
MỤC LỤC U VN ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1 y, CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN....................................................................................2 ac 1.1. TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP ................................................................... 2 rm 1.1.1. Tên khoa học .....................................................................................................2 1.1.2. Đặc điểm thực vật .............................................................................................2 a 1.1.3. Đặc điểm phân bố và sinh thái ..........................................................................2 Ph 1.1.4. Thành phần hóa học ..........................................................................................3 1.1.5. Tác dụng dược lý...............................................................................................4 d 1.1.6. Công dụng .........................................................................................................4 an 1.2. TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2 ....................................................... 5 1.2.1. Công thức hóa học ............................................................................................5 ine 1.2.2. Tính chất lý hóa .................................................................................................5 1.2.3. Tác dụng sinh học .............................................................................................6 dic 1.2.4. Một số nghiên cứu định lượng stipuleanosid R2 bằng HPLC ..........................6 1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) ................. 6 Me 1.3.1. Nguyên tắc của HPLC .......................................................................................6 1.3.2. Một số thông số đặc trưng .................................................................................7 of 1.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích HPLC ........................................................9 1.3.4. Tổng quan các nghiên cứu định lượng thành phần hóa học của Sâm vũ diệp ol bằng HPLC ..................................................................................................................9 ho CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................10 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ......................................................................... 10 Sc 2.1.1. Nguyên liệu sâm vũ diệp .................................................................................10 2.1.2. Chất tinh khiết stipuleanosid R2 .....................................................................10 @ 2.1.3. Dung môi, hóa chất .........................................................................................11 2.1.4. Máy móc, dụng cụ ...........................................................................................11 ht 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................ 12 rig 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................... 12 2.3.1. Phương pháp chiết xuất các hợp chất ..............................................................12 py 2.3.2. Phương pháp định lượng stipuleanosid R2 trong cao rễ SVD bằng HPLC ....13 Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
2.3.3. Định lượng stipuleanosid R2 trong cao sâm vũ diệp và dược liệu sâm vũ diệp U ...................................................................................................................................16 VN 2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ............................................................... 16 CHƯƠNG 3 – KẾT LUẬN VÀ BÀN LUẬN ........................................................17 y, 3.1. KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT CỦA STIPULEANOSID R2 PHÂN LẬP ĐƯỢC ....................................................................................................................... 17 ac 3.1.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng ........................................................................17 rm 3.1.2. Phương pháp HPLC ........................................................................................17 3.1.3. Phương pháp đo độ nóng chảy ........................................................................20 a 3.2. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 Ph BẰNG HPLC ........................................................................................................... 20 3.2.1. Chương trình sắc ký ........................................................................................20 d 3.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng ...............................................................20 an 3.3. ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP ......................................................................................................................... 27 ine 3.4. BÀN LUẬN ....................................................................................................... 28 3.4.1. Về xây dựng phương pháp định lượng stipuleanosid R2 bằng HPLC............28 dic 3.4.2. Về định lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu và cao sâm vũ diệp ............29 Me KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................31 of ol ho Sc @ ht rig py Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
ĐẶT VẤN ĐỀ U Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm - Araliaceae), còn VN gọi là Trúc tiết nhân sâm, Tam thất lá xẻ, Sâm hai lần xẻ, Hoàng liên thất là một vị thuốc quý phân bố ở Trung Quốc và dãy núi Hoàng Liên Sơn Tây Bắc nước ta y, [3,22]. Gần đây sâm vũ diệp đã được thuần hóa và bước đầu được trồng thử nghiệm ac ở một số địa phương ở Hà Giang, Lào Cai. Về mặt y học, sâm vũ diệp được sử dụng làm thuốc bổ và là thành phần trong một số bài thuốc truyền thống của các dân tộc rm vùng núi Tây Bắc [3,22]. Theo như các tài liệu đã được công bố về sâm vũ diệp cho thấy các saponin là thành phần hoạt chất chính mang lại tác dụng dược lý và giá trị a sử dụng của dược liệu quý này trong y học. Do vậy, việc tập trung nghiên cứu thành Ph phần saponin trong SVD cũng như định lượng được các thành phần đó có ý nghĩa rất quan trọng trong việc ứng dụng dược liệu SVD trong thực tiễn. d an Qua quá trình tra cứu tài liệu, chúng tôi thấy rằng ở trong nước ta có rất ít nghiên cứu về thành phần hóa học, tác dụng sinh học và tác dụng dược lý của sâm vũ diệp để phát triển sử dụng dược liệu quý thuộc chi sâm Panax này. Trên cơ sở ine đó, chúng tôi đã thực hiện đề tài nghiên cứu về thành phần hóa học của thân rễ cây SVD thu hái ở Sapa, Lào Cai với các hợp chất saponin phân lập được từ phân đoạn dic buthanol và đã xác định được stipuleanosid R2 là thành phần saponin chính có trong thân rễ SVD [24]. Tiếp nối nghiên cứu trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Định lượng Me stipuleanosid R2 trong thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”. Kết quả của đề tài sẽ là cơ sở cho việc of xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lượng dược liệu sâm vũ diệp phục vụ việc quản lý chất lượng dược liệu trên thị trường và tối ưu hóa quy trình chiết xuất ol saponin của SVD sau này. ho Mục tiêu đề tài: 1. Xây dựng phương pháp định lượng stipuleanosid R2 bằng phương pháp sắc ký Sc lỏng hiệu năng cao (HPLC). 2. Xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong cao sâm vũ diệp và dược liệu sâm vũ @ diệp thu hái ở Tây Bắc. Đề tài này là một phần trong đề tài cấp Nhà nước thuộc Chương trình Tây ht Bắc “Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên rig liệu và tạo sản phẩm từ hai loài cây Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.)”, mã số: KHCN- py TB.07C/13-18. Co 1 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN U 1.1. TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP VN 1.1.1. Tên khoa học SVD có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem. [3,21], SVD thuộc chi y, Sâm (Panax. L), họ Ngũ gia bì (Araliaceae) [2]. ac 1.1.2. Đặc điểm thực vật rm Sâm vũ diệp là cây thân thảo sống nhiều năm, ưa bóng và đặc biệt ưa ẩm [3,21]. Thân rễ dài có nhiều đốt và những vết sẹo do thân rụng hàng năm để lại. a Ph Thân khí sinh mảnh, cao 20 - 30 cm, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc, thường lụi vào mùa đông, mọc chồi thân mới từ giữa tháng 2 đến đầu tháng 3 dương lịch. Lá kép chân vịt, gồm 2 - 3 cái mọc vòng. Lá chét 5 - 7 (ít khi 3) d thuôn, dài 2,5 - 14 cm, rộng 1,5 - 4 cm, gốc tròn, đầu thuôn thành mũi nhọn, xẻ thùy an không đều, mép có răng cưa, có lông. ine dic Me of ol Hình 1.1. Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)[3,21] ho 1.1.3. Đặc điểm phân bố và sinh thái Sc Sâm vũ diệp là loài sâm mọc tự nhiên và được phát hiện tương đối sớm ở nước ta. Trong tự nhiên, SVD phân bố ở dãy núi Hoàng Liên Sơn: huyện Sa Pa, Bát @ Xát - Lào Cai và huyện Than Uyên - Lai Châu Tây Bắc nước ta [3,21,22]. Gần đây sâm vũ diệp đã được nghiên cứu và bước đầu được trồng thử nghiệm ở một số địa ht phương ở Hà Giang, Lào Cai. Hiện nay vùng phân bố của SVD đang bị thu hẹp dần và đứng trước nguy cơ tuyệt chủng. Do vậy SVD là loài dược liệu quý hiếm cần rig được bảo tồn và gìn giữ để phát triển trong tương lai. py Sâm vũ diệp thường mọc rải rác hay tập trung dưới tán rừng ẩm, gần như quanh năm có sương mù. Hàng năm vào cuối tháng 2 đầu tháng 3, từ phần đầu mầm Co 2 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
thân rễ phân nhánh ngang nằm sát mặt đất sẽ mọc lên một hoặc vài chồi thân (tùy U thuộc vào số đầu mầm thân rễ phân nhánh). Chồi này sinh trưởng nhanh trong vòng VN một tháng đã ra lá và gần đạt được chiều cao cực đại. Đến tháng 4, mỗi thân mang lá có thể cho ra một cụm hoa. Quả xanh quan sát được vào cuối tháng 4 – 6, đến tháng 7 quả đã chín và rụng xuống xung quanh gốc cây mẹ. Do quả chín đúng vào y, thời kì có lượng mưa lớn tháng 7 – 8 nên hạt giống thường bị cuốn trôi, ảnh hưởng ac đến khả năng tái sinh tự nhiên của sâm vũ diệp. Cách xác định tuổi của cây dựa vào rm những vết sẹo thân được hình thành sau khi quả chín [3]. 1.1.4. Thành phần hóa học a Ph Theo các tài liệu đã nghiên cứu cho thấy Saponin được xem là thành phần hoạt chất chính trong các loài thuộc chi Panax L.. Các nhà khoa học đã chiết tách và xác định được gần 300 saponin từ các loài thuộc chi này [31]. Các kết quả d an nghiên cứu trước đây của SVD cũng chỉ ra rằng saponin là thành phần chính của lá và rễ cây sâm vũ diệp, trong đó bao gồm saponin khung oleanan với hàm lượng tương đối cao cùng với một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp hơn ine [11,23]. dic Năm 1989, các nhà khoa học Trung Quốc đã công bố phân lập được 13 saponin khung dammaran từ lá của cây này ở Trung Quốc trong đó bao gồm một số Me ginseng saponin đặc trưng như ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re và Rb3 [37]. Nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự vào năm 2002 cho thấy kết quả of định tính sơ bộ trong thân rễ và rễ củ SVD có chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin cùng với acid béo, acid amin [21]. Năm 2003, đã xác định thành phần ol saponin ở thân rễ SVD chủ yếu là saponin triterpen thuộc nhóm oleanan gồm những ho chất như chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginsenosid Ro. Ngoài ra còn có các saponin triterpen nhóm dammaran như Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2 [22]. Sc Gần đây vào năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc đã phân lập và xác định được một nhóm gồm 10 saponin khung oleanan (1-10, hình 1.2) là @ thành phần chính của rễ cây sâm vũ diệp được thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn (Việt Nam), trong đó có 3 chất mới bifinosid A-C (1-3) [33]. ht rig py Co 3 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
U VN y, ac a rm Ph d an ine Hình 1.2. Các hợp chất tách được từ rễ cây sâm vũ diệp [33] 1.1.5. Tác dụng dược lý dic Tính vị, công năng: Sâm vũ diệp có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng dưỡng huyết, hoạt lạc, chỉ huyết, tán ứ [3]. Me Một số nghiên cứu về tác dụng dược lý của SVD cho thấy khi thử trên động vật thí nghiệm, SVD có độc tính cấp rất thấp, tăng cường chức năng sinh lý, ảnh of hưởng tốt đến hệ thần kinh trung ương, tăng sức dẻo dai của cơ thể, tăng sức đề ol kháng, tác dụng tán huyết [3]. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự đã chỉ ra rằng SVD có tác dụng chống stress [25], chống trầm cảm, có tác dụng bảo ho vệ gan và kích thích tăng miễn dịch [12-15]. Sc 1.1.6. Công dụng Sâm vũ diệp được biết đến như một vị thuốc quý có tác dụng chống ung thư, @ chống oxy hóa, bổ dưỡng, tăng trí nhớ [25], chữa thiếu máu, xanh xao, gầy yếu, nhất là đối với phụ nữ sau khi sinh. Sâm vũ diệp còn được dùng để cầm máu, tán ứ, ht tiêu sưng. Dùng ngoài, rễ phơi khô, tán bột mịn, rắc chữa chảy máu và làm vết rig thương mau lành. Rễ cây sâm vũ diệp còn được ngâm rượu rồi chiết dưới dạng tinh sâm dùng rất tốt cho sức khỏe đặc biệt là chức năng sinh dục. Ngoài ra nhân dân ở py vùng trồng còn tận dụng cả thân và lá nấu cao rồi dùng để pha với nước hoặc rượu Co 4 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
để uống cũng có tác dụng như rễ. Ở Trung Quốc, sâm vũ diệp còn được dùng làm U thuốc chữa lao, chảy máu cam, thổ huyết, đòn ngã tổn thương [7,22]. VN 1.2. TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2 1.2.1. Công thức hóa học y, ac a rm d Ph an ine dic Hình 1.3. Công thức cấu tạo của stipuleanosid R2 [41] Me Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: (2S,3S,4R,5R,6R)-6-[[(3S,4aR,6aR,6bS,8aS,12aS,14aR,14bR)-4,4,6a,6b,11,11,14b- of heptamethyl-8a-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2- ol yl]oxycarbonyl-1,2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14,14a-tetradecahydropicen-3-yl]oxy]- ho 3-[(2S,3R,4R,5S)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-5-hydroxy-4- [(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxane-2- Sc carboxylic acid [40]. Công thức phân tử: C53H84O23 [41]. @ Phân tử lượng: 1089.232 g/mol [42]. ht 1.2.2. Tính chất lý hóa rig Chất bột màu trắng. Độ tan: 0,57 g/L [42]. py Điểm nóng chảy 210 - 2150C [41]. Co 5 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
1.2.3. Tác dụng sinh học U Stipuleanosid R2 là thành phần saponin trong dược liệu, được biết đến như là VN thành phần có hoạt tính và quyết định các tác dụng sinh học của các loài dược liệu như: sâm vũ diệp, tam thất hoang, Aralia taibaiensis [36], Aralia elata [34] ... Trong y, một số nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng stipuleanosid R2 có tác dụng gây độc ac tế bào ung thư [30]; ức chế sự gia tăng các tế bào ung thư bạch cầu đặc biệt là đối với dòng tế bào K562 và U937 [29]; có tác dụng chống oxy hóa [38]; hạ đường rm huyết, điều hòa miễn dịch và hạ lipid máu [37]. a 1.2.4. Một số nghiên cứu định lượng stipuleanosid R2 bằng HPLC Ph Theo như tài liệu chúng tôi tìm hiểu được tính đến thời điểm hiên tại: Trên thế giới vẫn chưa có các nghiên cứu công bố về định lượng hàm lượng stipuleanosid R2 d trong dược liệu bằng phương pháp HPLC mà chủ yếu mới chỉ dừng lại ở việc phân lập an chất này trong các dược liệu. Do đó việc xây dựng được phương pháp định lượng stipuleanosid R2 là rất cần thiết trong việc ứng dụng dược liệu trong thực tiễn. ine 1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) dic 1.3.1. Nguyên tắc của HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một một phương pháp tách các chất ra khỏi hỗn Me hợp phân tích; dựa trên cơ sở là sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động dưới áp suất cao. Trong đó: pha động là chất lỏng; pha tĩnh là một chất rắn dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ trên một of chất mang rắn, hay một chất mang đã được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ. ol Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay dựa ho trên phân bố theo kích cỡ là tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai Sc pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của chất này với pha tĩnh và pha động dẫn tới thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột sẽ khác nhau và từ đó giúp phân tách được @ các chất. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bằng detector. Detector sẽ ht giúp phát hiện và đo nồng độ các chất phân tích. Hiện nay có rất nhiều loại detector rig được sử dụng như: detector UV-Vis, detector huỳnh quang (FLD), detector diode py array (DAD), detector điện hoá,…Trong đề tài này chúng tôi sử dụng detector DAD. Co 6 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
Nếu thực hiện quá trình tách sắc ký của hỗn hợp nhiều thành phần, ta sẽ thu U được kết quả là một sắc đồ gồm nhiều pic. Quá trình sắc ký tốt thì hỗn hợp gồm VN nhiều thành phần sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt được tách ra trên sắc ký đồ [4,5,8,20,27,28]. y, 1.3.2. Một số thông số đặc trưng [2,3,5,9,10,15] ac a rm d Ph an ine Hình 1.4. Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng [9] dic a) Thời gian lưu Me t0 (Thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc ký. tR (Thời gian lưu): là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào hệ of thống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó. ol tR’(Thời gian lưu thực): tR’= tR – t0. ho (Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc ký đồ với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong một điều kiện nhất định). Sc b) Hệ số dung lượng k’ Trong thực nghiệm hệ số dung lượng k’ được tính theo công thức: @ t 'R t R -t 0 t R ht k'= = = -1 t0 t0 t0 rig Hệ số dung lượng cho biết khả năng phân bố của chất đó vào hai pha, tức là py tỷ lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động tại thời điểm cân bằng. Nếu k’ nhỏ thì tR cũng nhỏ, chất bị rửa giải gần với thời điểm bơm Co 7 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
mẫu do đó làm giảm khả năng tách, nếu k’ lớn quá thì sẽ dẫn đến doãng pic, độ U nhạy thấp và thời gian lưu kéo dài. Trong thực tế k’ nằm trong khoảng 2 - 5 là tốt VN nhất. c) Hệ số bất đối AF (tailing factor) y, Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ: ac rm AF  W 1/20 2a a Ph Trong đó: - W1/20: là chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic. d - a: là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong an phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic. ine Yêu cầu trong phép định lượng: 0,9 < AF < 2. Giá trị của AF càng gần 1 thì pic càng cân đối. dic d) Hệ số chọn lọc Me ' t R,B-t 0 α= k B = (k’B  k’A) k 'A t R,A -t 0 of Yêu cầu: α nằm trong khoảng 1,05 đến 2. α khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng. ol e) Độ phân giải (resolution) ho Độ phân giải đặc trưng cho mức độ tách 2 chất ra khỏi nhau trên một điều Sc kiện sắc ký. Độ phân giải của 2 pic kề nhau được tính theo công thức: 2t R,B  t R,A  1,18t R,B  t R,A  N  α  1  k'B  @ RS       WB WA   W1/2B W1/2A 4  α 1   k B  ' ht - RS = 1,5: độ phân giải cơ bản đạt được, khi đó 2 pic tách khỏi nhau rõ ràng, rig chỉ xen phủ nhau 0,3%. - Rs = 1,0: Hai pic chưa tách hẳn còn xen phủ nhau 4%. py - RS = 0,75: Hai pic chưa tách nhau. Co 8 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
1.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích HPLC U a) Yêu cầu chung VN Các quy trình phân tích HPLC cần phải thẩm định là các quy trình chưa được công bố trong tiêu chuẩn Dược điển các nước. Nội dung về thẩm định phương pháp được hướng dẫn trong các tài liệu về phân tích và được quy định trong các y, Dược điển. ac b) Nội dung thẩm định rm Thông số đặc trưng của kỹ thuật HPLC cần đánh giá khi thẩm định phương pháp định lượng dược chất chính, đa lượng bao gồm: tính thích hợp hệ thống, độ a đặc hiệu, độ tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng. Ph 1.3.4. Tổng quan các nghiên cứu định lượng thành phần hóa học của Sâm vũ d diệp bằng HPLC an Năm 2009, nhóm nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự đã định lượng hàm lượng saponin tổng số của thân rễ và rễ củ của Sâm vũ diệp theo phương pháp ine trọng lượng của Namba là 5,86% [17]. Năm 2017, Nhóm nghiên cứu của Khoa Y dược - Đại học Quốc gia Hà Nội: dic Nguyễn Thị Huệ đã tiến hành khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký và xây dựng phương pháp định lượng acid oleanolic và saponin toàn phần trong dược liệu sâm Me vũ diệp bằng phương pháp HPLC - DAD. Kết quả định lượng cho thấy hàm lượng acid oleanolic trong cao sâm vũ diệp và rễ sâm vũ diệp lần lượt là: 0,034% và of 0,0066% tương đương với 340 μg/g và 66 μg/g; hàm lượng saponin trong cao sâm vũ diệp và dược liệu SVD lần lượt là 0,364% và 0,0698% tương đương 3640 µg/g ol 698 μg/g [11]. ho Nhận xét: Đây là những kết quả bước đầu về định lượng thành phần hóa học của SVD và xác định hàm lượng saponin tổng số. Tính thời điểm hiện tại, chưa có Sc nhiều kết quả công bố phân tích và định lượng các thành phần saponin cụ thể có trong sâm vũ diệp. Trong nghiên cứu này chúng tôi phân tích định lượng thành phần @ saponin trong SVD bằng phương pháp HPLC, hiện đang là phương pháp được Dược điển các nước công nhận đạt yêu cầu về tính tiên tiến so với phương pháp ht quang phổ hay phương pháp khối lượng của phần lớn các chuyên luận dược liệu rig hiện nay. Phương pháp HPLC với ưu điểm là độ chính xác cao sẽ đáp ứng được yêu cầu phân tích từng thành phần riêng lẻ có trong mẫu, đặc biệt là đối với các mẫu py phức tạp như cao chiết từ dược liệu. Co 9 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU U 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VN 2.1.1. Nguyên liệu sâm vũ diệp Mẫu nghiên cứu trong đề tài là thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus y, Seem.) được trồng ở Sa Pa, Lào Cai và thu hái vào ngày 15/7/2016. Mẫu nghiên ac cứu được giám định tên khoa học bởi ThS. Nguyễn Quỳnh Nga và CN. Phan Văn rm Trường, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu. Mẫu tiêu bản (PB-150716) được lưu giữ Phòng tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu. a Mô tả mẫu nghiên cứu: Thân rễ sâm vũ diệp có nhiều đốt và những vết sẹo, Ph cong ngoằn ngoèo, dài 7-12 cm, đường kính 1,2-1,8 cm. Thể chất cứng chắc, giòn, dễ bẻ, mặt bẻ lởm chởm, màu vàng nâu nhạt. Mùi thơm nhẹ, vị đắng, hơi ngọt. d Cách xử lí mẫu: thân rễ SVD thu hái tại Sa Pa được rửa sạch, cắt miếng an mỏng, sấy khô ở 500C, bảo quản trong túi nilong kín, để nơi khô ráo, thoáng mát ine làm nguyên liệu nghiên cứu. dic Me of ol ho Sc Hình 2.1. Mẫu sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa Pa, Lào Cai vào ngày 15/7/2016 @ 2.1.2. Chất tinh khiết stipuleanosid R2 Trong đề này chúng tôi sử dụng chất stipuleanosid R2 được phân lập từ dược liệu ht sâm vũ diệp trong một nghiên cứu trước của cùng nhóm nghiên cứu với chúng tôi rig [24]. Stipuleanosid R2 phân lập được sẽ được tiến hành đánh giá độ tinh khiết đạt tiêu chuẩn để sử dụng làm chất chuẩn trong phương pháp định lượng nồng độ chất py này có trong SVD bằng HPLC. Co 10 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
U VN y, ac a rm Hình 2.2. Hình ảnh stipuleanosid R2 phân lập được Ph 2.1.3. Dung môi, hóa chất d Dung môi, hóa chất: Các hóa chất và dung môi dùng trong nghiên cứu đề tài an đạt tiêu chuẩn tinh khiết (PA) và loại tinh khiết dùng trong HPLC. - Dung môi dùng cho chiết xuất và phân lập: Ethanol 70%, methanol ine (MeOH), ether, ethylacetat (EtOAc), n-butanol (BuOH). dic - Dung môi chạy sắc ký HPLC (Methanol, Acetonitril, Acid acetic) của Merck, Đức; nước cất hai lần dùng cho phân tích HPLC đạt tiêu chuẩn Dược điển Me Việt Nam IV. 2.1.4. Máy móc, dụng cụ of Trong quá trình nghiên cứu đề tài, chúng tôi đã sử dụng các thiết bị, dụng cụ đáp ứng tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 và GLP tại Khoa Y Dược, ĐH Quốc gia Hà ol Nội: ho - Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ) với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tự động. Sc - Tủ sấy Memmert (Memmert – Đức). @ - Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (sai số 0,0001 g, Precisa - Thụy Sĩ). ht - Cân xác định độ ẩm Prescisa HA 60. rig - Hệ thống chiết hồi lưu dung tích bình cầu 1000 ml. py - Máy siêu âm Power sonic 405 (Powersonic - Hàn Quốc). Co - Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi, Thụy Sĩ). 11 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- Bếp điện, bếp đun cách thủy. U - Đèn tử ngoại. VN - Cột sắc ký các loại kích cỡ. - Màng lọc 0,45 µm. y, - Dụng cụ thủy tinh: bình gạn, bình nón, phễu lọc, cốc có mỏ, bình định mức, ac bình cầu dung tích 50 - 2000 ml, ống nghiệm, pipet chính xác. rm - Tủ hút. a 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Ph 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ SVD bằng HPLC với chất chuẩn là stipuleanosid R2 tinh khiết được phân d lập từ SVD. an 2. Xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ SVD thu hái ở Sa Pa, Lào Cai bằng phương pháp HPLC đã xây dựng và thẩm định ở trên. ine 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU dic 2.3.1. Phương pháp chiết xuất các hợp chất Các nghiên cứu về thành phần hoạt chất trong sâm vũ diệp đều cho thấy sâm Me vũ diệp có chứa thành phần chính là saponin, tham khảo các tài liệu về chiết xuất saponin và sapogenin trong dược liệu để tìm ra phương pháp chiết xuất phù hợp of nhất với mẫu nghiên cứu là thân rễ SVD [23]. - Phương pháp chiết mẫu: chiết hồi lưu đơn giản với dung môi ethanol 70%. ol ho - Phương pháp chiết phân đoạn: phương pháp chiết lỏng - lỏng. Quy trình chiết xuất được thực hiện như sau: Sc 1. Thân rễ SVD sau khi rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ được chiết hồi lưu bằng dung môi EtOH 70% ở nhiệt độ 700C, chiết 3 lần. @ 2. Tiến hành lọc loại bã dược liệu, các dịch chiết ethanol thu được lọc qua ht giấy lọc, gom lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao tổng ethanol. rig 3. Cao ethanol này đem phân tán trong nước rồi lắc lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần ether, ethyl acetate và n-butanol lặp lại 3 lần theo tỷ lệ py 1:1. Các phân đoạn ether, ethyl acetat, n-butanol đem cất quay chân không dưới áp Co 12 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma