Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học: Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của cao giàu saponin của Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng)

Chia sẻ: Chuheo Dethuong25 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:48

Thêm vào BST

Báo xấu

29
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Khóa luận được nghiên cứu với mục tiêu nhằm đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của cao giàu saponin Sâm vũ diệp và Tam thất hoang trên in vitro. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học: Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của cao giàu saponin của Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y – DƯỢC LÊ THỊ THANH HOA NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU IN VITRO CỦA CAO GIÀU SAPONIN SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus Seem.) VÀ TAM THẤT HOANG (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2018
LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Y Dược, ĐHQGHN, Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Bộ môn Y Dược học cơ sở, các thầy cô giáo trong U khoa đã tạo điều kiện học tập, nghiên cứu cho em trong thời gian qua, giúp em hoàn VN thành chương trình học. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Vũ Thị Thơm, PGS.TS. y, Dương Thị Ly Hương, hai giảng viên mẫu mực dẫn dắt em từ những ngày đầu tiên ac của đề tài, truyền cho em nhiều động lực và kiến thức quý báu giúp em hoàn thành rm khoa luận một cách tốt nhất. ha Em cũng xin cảm ơn đề tài thuộc chương trình Tây Bắc: “Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ hai dP loài cây thuốc Sâm vũ diệp (Panaxbipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsaiet K.M. Feng) vùng Tây Bắc”, mã số KHCN-TB.07C/13-18 đã an tài trợ kinh phí giúp em hoàn thành nội dung nghiên cứu này. Cảm ơn Khoa xét ine nghiệm Huyết Học, Bệnh viện Bạch Mai tạo điều kiện cho em thực hiện thí nghiệm. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè, đặc biệt là dic mẹ em đã luôn quan tâm, hỗ trợ, động viên giúp em hoàn thành khóa luận này. Me Lần đầu viết khóa luận, mặc dù rất cố gắng nhưng khó tránh được sai sót. Em rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô để khóa luận được hoàn thiện hơn. of Em xin chân thành cảm ơn! ol Hà Nội, tháng 05 năm 2017 ho Sinh viên Sc t© Lê Thị Thanh Hoa gh p yri Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Giải nghĩa AA Acid arachidonic U ADP Adenosin diphosphat VN AMP Adenosin monophosphat ATP Adenosin triphotphat y, CADP Collagen Adenosin diphotphat (Collagen+ADP) ac CEPI Collagen Epinephrin rm COX-1 Cyclooxygenase 1 CT Thời gian lấp kín (Closure time) ha EtOH Alcol etylic dP GP Glycoprotein IC 50 Liều ức chế 50 % đối tượng thử (Inhibitory concentration 50%) an LC 50 Liều gây chết 50% đối tượng thử (Lethal Dose 50%) ine MDA Malondialdehyde Độ ngưng tập tiểu cầu tối đa (Maximum platelet dic MPA aggregation) Me FPA Phần trăm ngưng tập tiểu cầu điểm cuối (Final platelet aggregation) of NTTC Ngưng tập tiểu cầu PPP Huyết tương nghèo tiểu cầu (Platelet Poor Plasma) ol PRP Huyết tương giàu tiểu cầu (Platelet Rich Plasma) ho SVD Sâm vũ diệp Sc TTH Tam thất hoang TXA2 Thromboxan A2 t© vWF Von-Willerbrand Diện tích dưới đường cong gh AUC HMWK Kininogen cao phân tử (High molecular weight kininogen) yri PDGF Yếu tố phát triển (platelet derived growth factor) p CTAP Peptid hoạt hóa tổ chức liên kết (connective tissue Co activating peptid) PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên Bảng Trang Bảng 3.1 Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) của cao giàu saponin U 26 của Sâm vũ diệp VN Bảng 3.2 Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa của cao giàu saponin 27 Sâm vũ diệp y, Bảng 3.3 Tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope) của cao giàu saponin ac 27 Sâm vũ diệp rm Bảng 3.4 Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) của cao giàu saponin 29 Tam thất hoang ha Bảng 3.5 Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa của cao giàu saponin dP 30 Tam thất hoang Bảng 3.6 Tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope) của cao giàu saponin Tam thất hoang an 30 ine dic Me of ol ho Sc t© gh p yri Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên Hình Trang Hình 1.1 Sâm vũ diệp 3 U Hình 1.2 Tam thất hoang 3 VN Hình 1.3 Các glycoprotein màng tiểu cầu và chức năng của chúng 7 Hình 1.4 Cấu trúc của tiểu cầu 9 y, Hình 1.5 Cơ chế gây ngưng tập tiểu cầu của ADP 11 ac Hình 1.6 Quá trình ngưng tập tiểu cầu 12 rm Hình 1.7 Nguyên lí của xét nghiệm đo độ ngưng tập tiểu cầu 15 Sơ đồ qui trình chiết cao giàu saponin Sâm vũ diệp ha Hình 2.1 19 Hình 2.2 Sơ đồ qui trình chiết cao giàu saponin Tam thất hoang 20 dP Hình 2.3 Qui trình đo độ ngưng tập tiểu cầu 22 Hình 2.4. Đồ thị ngưng tập tiểu cầu trên in vitro với chất kết tập ADP 23 Hình 2.5 Chỉ số Slope an 24 Chỉ số diện tích dưới đường cong – AUC ine Hình 2.6 25 Hình 3.1 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu của cao giàu saponin Sâm vũ diệp 28 dic Hình 3.2 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu của cao giàu saponin Tam thất hoang 31 Me of ol ho Sc t© gh p yri Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................3 U 1.1. Tổng quan về Tam thất hoang và Sâm vũ diệp ...............................................3 VN 1.1.1. Đặc điểm thực vật .............................................................................................3 y, 1.1.2. Thực trạng và phân bố ......................................................................................4 ac 1.1.3. Công dụng và tác dụng dược lý của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang .............4 rm 1.1.4. Thành phần hóa học ..........................................................................................5 ha 1.2. Sinh lý học tiểu cầu ............................................................................................6 dP 1.2.1. Cấu trúc tiểu cầu................................................................................................7 1.2.2. Chức năng tiểu cầu ............................................................................................9 an 1.3. Các xét nghiệm đánh giá chức năng tiểu cầu ................................................13 ine 1.3.1. Thời gian máu chảy .........................................................................................13 1.3.2. Đo sức bền mao mạch .....................................................................................13 dic 1.3.3. Đếm số lượng tiểu cầu ....................................................................................14 Me 1.3.4. Quan sát hình thái và độ tập trung của tiểu cầu trên tiêu bản nhuộm Giêmsa ........ 14 of 1.3.5. Co cục máu đông .............................................................................................14 ol 1.3.6. Đo độ dính tiểu cầu .........................................................................................15 ho 1.3.7. Đo độ ngưng tập tiểu cầu ................................................................................15 Sc 1.4. Các thuốc kháng tiểu cầu ................................................................................16 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................18 t© 2.1. Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu .............................................................18 gh 2.2. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................21 yri CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................26 p Co 3.1. Kết quả ..............................................................................................................26 3.1.1 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của Sâm vũ diệp ......................................26 3.1.2 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của Tam thất hoang.................................29 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
3.2. Bàn luận ............................................................................................................32 3.2.1. Mô hình nghiên cứu ........................................................................................32 3.2.2. Kết quả nghiên cứu .........................................................................................33 U 3.2.4. Hạn chế của nghiên cứu ..................................................................................35 VN Kết luận ....................................................................................................................36 Đề xuất......................................................................................................................37 y, ac TÀI LIỆU THAM KHẢO rm ha dP an ine dic Me of ol ho Sc t© gh p yri Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, huyết khối là một trong ba nhóm bệnh có tỷ lệ tử vong cao nhất thế giới, là nguyên nhân gây tắc mạch máu, nhồi máu cơ tim, đột quỵ do thiếu máu cục bộ, hoại tử chi, thuyên tắc phổi, tăng huyết áp…[41]. Những nghiên cứu gần U đây cho thấy yếu tố có vai trò quan trọng bậc nhất đối quá trình hình thành huyết VN khối là tiểu cầu. Sau khi được kích hoạt, tiểu cầu thực hiện quá trình bám dính, thay đổi hình dạng, ngưng tập, phóng thích các chất làm tăng đáp ứng ngưng tập, tạo cục y, máu đông, dẫn đến hình thành huyết khối [23]. Trên lâm sàng, các thuốc kháng tiểu ac cầu là liệu pháp lý tưởng. Một số thuốc kháng tiểu cầu hiện có như: aspirin, rm clopidogrel, prasugrel, và dipyridamol được sử dụng rộng rãi trong dự phòng và điều trị huyết khối, bên cạnh những lợi ích, thuốc kháng tiểu cầu còn một số tác ha dụng phụ như: gây chảy máu, loét dạ dày, giảm tiểu cầu. Những hạn chế trên thúc dP đẩy việc nghiên cứu, phát triển thuốc kháng tiểu cầu mới mạnh hơn và ít tác dụng phụ hơn. Bên cạnh các thuốc tổng hợp, các thuốc có nguồn gốc tự nhiên cũng là đối tượng được quan tâm nghiên cứu [41]. an ine Việt Nam là vùng đất của nhiều loài thảo dược quý, trong đó có những cây thuốc được dân gian sử dụng từ hàng ngàn năm nay như các loại nhân sâm, tam dic thất... Tuy nhiên, các thảo dược này từ bao đời nay vẫn chỉ được sử dụng trực tiếp hoặc chế biến thành nguyên liệu thô, do vậy chưa phát huy được hết công dụng. Me Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) được xác định là loài cây quý hiếm và có nguy cơ tuyệt of chủng rất cao ở Việt Nam. Theo y học cổ truyền, Sâm vũ diệp và Tam thất hoang ol dùng làm thuốc bổ như các loại Sâm khác, có tác dụng tăng lực, chống mệt mỏi, ho giảm cholesterol, tăng cường sinh dục, chống stress [15]. Một số loài thuộc chi Sc Panax được nghiên cứu khá đầy đủ về dược lý, hóa học và độc tính. Tuy nhiên ở Việt Nam và trên thế giới, số lượng các nghiên cứu về tác dụng sinh học và thành t© phần hóa học hai loài cây này còn hạn chế. Các nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy trong rễ, lá của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang có chứa saponin (chất có gh khả năng chống ngưng tập tiểu cầu) với hàm lượng cao [13, 15, 36]. Giai đoạn trước yri của đề tài, đã chứng minh được Sâm vũ diệp có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu (NTTC) trên in vitro ở các phân đoạn và các mức liều: phân đoạn tổng, phân đoạn p Co n-butanol, phân đoạn etylacetat có tác dụng ở các mức liều 0,5-1-2-5 mg/mL, phân đoạn ete các mức liều 1-2-5 mg/mL. Tam thất hoang có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu trên in vitro ở các phân đoạn và mức liều: phân đoạn tổng ở mức liều 1-2-5 1 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
mg/mL, phân đoạn n-butanol ở mức liều 5 mg/mL, phân đoạn n-hexan các mức liều 0,5-1-2-5 mg/mL [19]. Saponin cũng là thành phần chính của phân đoạn n-butanol, tuy nhiên butanol là một dung môi hữu cơ, có ít nhiều độc tính nên trong sản xuất công nghiệp, người ta hạn chế dùng butanol để chiết xuất. Để khắc phục hạn chế U này, nhóm nghiên cứu của PGS. Đỗ Thị Hà (Viện Dược liệu) và Nguyễn Hữu Tùng VN (Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội) đã đưa ra một quy trình chiết cao giàu saponin mà không dùng butanol, với hiệu suất chiết cao Tam thất hoang là y, 20,59±0,27 %, Sâm vũ diệp là 14,44±0,14 % [8, 27]. Liệu cao này có còn hoạt tính ac chống ngưng tập tiểu cầu không? Và tác dụng của nó so với phân đoạn n-butanol rm như thế nào? Để trả lời những câu hỏi này, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của cao giàu saponin của Sâm vũ ha diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. dP Tsai et K. M. Feng)”, với mục tiêu: 1. Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của cao giàu saponin Sâm vũ diệp và Tam thất hoang trên in vitro. an ine dic Me of ol ho Sc t© gh p yri Co 2 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Tam thất hoang và Sâm vũ diệp 1.1.1. Đặc điểm thực vật U Sâm vũ diệp, còn gọi là Trúc tiết nhân Sâm, Tam thất lá xẻ, Sâm hai lần xẻ, VN Hoàng liên thất, Vũ diệp tam thất. Tên khoa học: Panax bipinnatifidus Seem., thuộc họ Nhân Sâm - Araliaceae [4, 20]. y, Sâm vũ diệp là cây thảo sống nhiều năm; rễ dài có nhiều đốt và những vết ac sẹo do thân rụng hằng năm để lại. Thân mảnh cao 10–20 cm, tới 50 cm, thường lụi rm vào mùa khô. Lá kép chân vịt, mọc vòng ba cái một, mang 3-7 lá chét mỏng, không lông, mép có răng đôi cạn hay sâu dạng thùy. Hoa màu trắng lục, xếp 20-30 cái ha thành tán đơn trên một trục dài 15-20 cm ở ngọn thân, cuống hoa cỡ 1 cm. Qủa dP mọng, khi chín màu đỏ, chứa 1-2 hạt [4]. Tam thất hoang được gọi với các tên khác là Tam thất rừng, Dã tam thất, an Bình biên tam thất, Thổ tam thất. Tên khoa học: Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng, họ Nhân Sâm (Araliaceae) [4, 20], cây thân thảo cao 25-75 cm; thân rễ ine mập, nằm ngang, có nhiều vết lõm do vết thân để lại, ít phân nhánh. Mỗi khóm dic thường có một thân mang lá. Lá kép chân vịt, gần 1-3 cái, mọc vòng ở ngọn; cuống dài 5-10 cm. Lá chét 5, có cuống ngắn, hình thuôn hay mác thuôn, dài 5-13 cm, Me rộng 2-4 cm, nhọn hai đầu, mép cuống hoa dài 1-1,5 cm. Hoa màu vàng xanh với năm lá đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 2 ô. Qủa mọng, gần hình cầu dẹt, đường of kính 0,6-1,2cm, khi chín màu đỏ. Hạt 1 hoặc 2, màu xám trắng [4, 25]. ol Hai loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang có hình thái tương đối giống nhau. Điểm ho khác biệt nhất là Sâm vũ diệp có lá xẻ thùy, còn Tam thất hoang thì không [20]. Sc t© gh p yri Co Hình 1.1. Sâm vũ diệp Hình 1.2. Tam thất hoang 3 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
1.1.2. Thực trạng và phân bố Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) được Seemann phát hiện lần đầu tiên tại vùng núi Hymalaya của Ấn Độ và được công bố năm 1868 trên tạp chí J. Botany. Trên thế giới, Sâm vũ diệp được tìm thấy ở Trung Quốc, bắc Myanma, U đông bắc Ấn Độ và Nepal. Ở nước ta, Sâm vũ diệp phân bố hẹp ở vùng núi Hoàng VN Liên Sơn (thuộc địa phận Sapa, Bát Xát, Lào Cai) và huyện Than Uyên (Lai Châu). Sapa chính là điểm cực nam của bản đồ phân bố Sâm vũ diệp trên thế giới ( khoảng y, 23 độ vĩ Bắc) [21, 53]. ac Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) được hai nhà rm khoa học người Trung Quốc công bố năm 1975 trên tạp chí Acta Phytotaxonomica Sinica. Loài này được tìm thấy đầu tiên tại khu rừng Mã Quan, Trung Quốc (phía ha bắc Việt Nam) ở độ cao 1100-1700 m so với mặt nước biển. Cho đến nay, trên toàn dP thế giới, loài này mới chỉ tìm thấy ở tỉnh Vân Nam (Trung Quốc) và một vài điểm ở Vườn Quốc gia Hoàng Liên Sơn thuộc tỉnh Lào Cai, Việt Nam [20]. an Tại Việt Nam cho đến nay, các kết quả nghiên cứu cho thấy hai loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang phân bố tự nhiên ở sườn tây bắc dãy Hoàng Liên Sơn và ine một vài nhánh phụ cận kề, thuộc địa phận của 6 xã thuộc huyện Bát Xát và Sa Pa dic của tỉnh Lào Cai [10, 20, 21]. Phạm vi phân bố của hai loài này rất hạn chế, các quẩn thể của chúng được tìm thấy trong tự nhiên với kích thước rất nhỏ. Tuy nhiên Me gần đây Sâm vũ diệp đã được thuần hóa và bước đầu được trồng thử nghiệm ở một số địa phương ở Hà Giang và Lào Cai [10]. of 1.1.3. Công dụng và tác dụng dược lý của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang ol Theo Đông y, Tam thất hoang có vị ngọt, hơi đắng, tính ấm. Có tác dụng tư ho bổ cường tráng, tiêu viêm giảm đau, khử ứ sinh tân và cầm máu. Sách đỏ Việt Nam Sc năm 2007 ghi “Tất cả các bộ phận của cây đều có thể dùng làm thuốc. Thân rễ thường được dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh dục, chống stress. Lá, t© nụ, hoa dùng làm trà uống có tác dụng kích thích tiêu hóa, an thần” [4]. Sâm vũ diệp vị đắng, nhạt, tính hàn, có tác dụng tư bổ cường tráng, tiêu gh viêm, giảm đau, khư ứ sinh tân và cầm máu. Dược liệu từ Sâm vũ diệp là thân rễ, rễ yri củ dùng cầm máu các loại vết thương và xuất huyết. Làm thuốc bổ chữa thiếu máu, xanh xao gầy còm nhất là đối với phụ nữ sau sinh đẻ; còn có tác dụng kích thích p Co sinh dục và được dùng trong điều trị vô sinh. Ở Vân Nam (Trung Quốc), người ta dùng rễ củ chữa thổ huyết, chảy máu mũi, đòn ngã tổn thương, thương tổn bên trong gây đau lưng [4]. 4 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
Nghiên cứu của Trần Công Luận năm 2002 công bố cao Tam thất hoang và Sâm vũ diệp có tác dụng phục hồi thời gian ngủ bị rút ngắn bởi stress, đưa về trạng thái bình thường ở các liều thử nghiệm 44, 88, 176 mg/kg. Cao saponin toàn phần của Tam thất hoang có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành MDA ở nồng U độ 25, 50, 100 µg/mL [13]. Năm 2009, nghiên cứu của Viện Dược liệu chỉ ra rằng VN phân đoạn saponin của Tam thất hoang có hoạt tính chống oxy hóa – lipid peroxidation, dịch chiết tổng ethanol có tác dụng chống trầm cảm ở liều 44-176 y, mg/kg trên chuột [14]. ac Năm 2017, nghiên cứu của Lê Thị Tâm cho thấy Sâm vũ diệp có tác dụng ức rm chế ngưng tập tiểu cầu trên in vitro ở các phân đoạn và các mức liều: phân đoạn tổng, phân đoạn n-butanol, phân đoạn etylacetat có tác dụng ở các mức liều 0,5-1-2- ha 5 mg/mL, phân đoạn ete các mức liều 1-2-5 mg/mL. Tam thất hoang có tác dụng ức dP chế ngưng tập tiểu cầu trên in vitro ở các phân đoạn và mức liều: phân đoạn tổng ở mức liều 1-2-5 mg/mL, phân đoạn n-butanol ở mức liều 5 mg/mL, phân đoạn n- hexan các mức liều 0,5-1-2-5 mg/mL) [19]. an ine 1.1.4. Thành phần hóa học 1.1.4.1. Sâm vũ diệp dic Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá và thân rễ Sâm vũ diệp cho thấy có Me nhiều saponin khung dammaran và oleanan. Năm 1989, Trung Quốc đã phân lập 13 saponin khung dammaran. Hai saponin mới đã được phân lập là bipinnatifidusoside of F1 và F2, cùng với 11 saponin đã biết từ lá khô của Sâm vũ diệp thu thập ở dãy núi Qinling Trung Quốc. Saponin đã biết được xác định là ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, ol Re, Rd, Rb1, Rb3, 24(S)-pseudoginsenosid F11, panasenosid và majorosid F1 [44]. ho Năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam- Hàn Quốc phân lập và xác định cấu trúc 10 Sc saponin khung oleanan từ thân rễ Sâm vũ diệp, được thu hái ở Hoàng Liên Sơn, Việt Nam, trong đó có 3 chất mới là bifinosid A-C (1-3) và 7 hợp chất đã biết, bao gồm: t© narcissiflorine methyl ester (4), chikusetsusaponin IVa (5), pseudoginsenoside RP1 methyl ester (6), stipuleanoside R1 (7), pseudoginsenoside RT1 methyl ester (8), gh momordinIIe (9), và stipuleanoside R2 methyl ester (10) [40]. Năm 2015, nhóm tác giả yri Viện Dược liệu bước đầu nghiên cứu thành phần hoá học của Sâm vũ diệp, kết quả là đã phân lập được một hỗn hợp saponin (11) bao gồm: stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid p (11A) và β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (11B), glycosphingolipid: 1-O-(β-D- Co glucopyranosyl)-N-(1,3,4-trihydroxytridec-8-en-2-yl) heptacosanamid (12), dichaccarid: saccharose (13), saponin: 28-desglucosylchikusetsusapnin IV (14) từ phân đoạn chiết ethyl acetat thân rễ Sâm vũ diệp. Đây là lần đầu tiên một số hợp chất trên được công 5 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
bố phân lập từ cây này [9]. Năm 2017, rễ Sâm vũ diệp thu hái ở Sa Pa, Lào Cai đã được nhóm nghiên cứu Khoa Y Dược xác định được 3 cấu trúc hóa học trên cơ sở phân tích quang phổ và so sánh với chất tham khảo, bao gồm: Stigmast-5-en-3-ol hay còn gọi là β-sitosterol (1), acid oleanolic (2) và daucosterol (3) từ phân đoạn U cao chiết etyl acetate của cao chiết tổng ethanol Sâm vũ diệp [11]. Trong ba chất VN phân lập được thì oleanolic acid là sapogenin của các saponin khung olean có ý nghĩa trong đánh giá hàm lượng tổng saponin có trong Sâm vũ diệp [10]. y, 1.1.4.2. Tam thất hoang ac Cho đến nay, chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của Tam thất rm hoang được công bố. Một số nghiên cứu tập trung vào phần thân rễ của loài này chỉ ha ra rằng phần thân rễ Tam thất hoang chứa nhiều saponin khung oleanan (hầu hết đều là saponin dẫn chất acid oleanolic) với hàm lượng tương đối cao cùng một số dP saponin khung dammaran với hàm lượng thấp. Năm 1985, nhóm các nhà nghiên cứu ở Trung Quốc phân lập 2 saponin loại dẫn chất acid oleanolic và đặt tên là an stipuleanosid R1 và stipuleanosid R2 từ thân rễ Tam thất hoang [43]. Năm 2002, trên cơ sở phân tích bằng HPLC-MS/MS, nhóm nghiên cứu ở Đại học Toyama ine (Nhật Bản) phát hiện thêm thành phần saponin khung dammaran gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd với hàm lượng nhỏ từ dich chiết ethanol của Tam dic thất hoang được thu hái ở Trung Quốc [36]. Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Chun Me Liang đã phân lập được 11 hợp chất saponin từ mẫu Tam thất hoang thu hái ở Việt Nam trong đó có 1 chất mới là spinasaponin A methyl ester (1) [33]. Năm 2013, of nhóm tiếp tục phân lập được 4 hợp chất saponin nữa đều là các saponin khung oleanan [38]. Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng đã phân lập được một số hợp chất ol khác từ Tam thất hoang gồm 2 polyacetylen mới (stipudiol và stipuol), 1 ho polyacetylen đã biết (3R,9R,10R)- panaxytriol và các hợp chất khác: spathulenol Sc (serquiterpen) và 9- docosenoic acid methyl ester (acid béo) [48]. Ở Việt Nam, nghiên cứu về thành phần hóa học của Tam thất hoang vẫn còn mới mẻ. Năm 2002, t© Trần Công Luận đã phát hiện sự có mặt của hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin cùng với acid béo, acid amin, tanin bằng phương pháp thử định tính hóa gh học và phân tích sơ bộ sắc ký lớp mỏng [14]. Đồng thời bằng cách thủy phân yri saponin rồi kết tinh sapogenin toàn phần thu được acid oleanolic [13]. p 1.2. Sinh lý học tiểu cầu Co Tiểu cầu là tế bào máu nhỏ nhất, không có nhân, đường kính 3-4 µm, được sản xuất từ mẫu tiểu cầu, nguyên mẫu tiểu cầu bắt đầu từ tế bào nguồn dòng tủy, do tế bào gốc sinh máu tạo nên. Mỗi mẫu tiểu cầu có thể tạo được 3000 tiểu cầu. Số 6 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
lượng tiểu cầu lưu hành ở máu ngoại vi khoảng 150 - 450 × 109/L [18, 29]. Tiểu cầu có đời sống ngắn, khoảng từ 8-14 ngày. Hiện nay có thể giữ tiểu cầu trong 7 ngày ngoài cơ thể ở nhiệt độ 20-22 °C, lắc liên tục [18]. 1.2.1. Cấu trúc tiểu cầu. U VN Tiểu cầu có một cấu trúc phức tạp gồm 4 khu vực: khu ngoại vi, khu sol-gel, khu bào quan và khu màng y, Khu ngoại vi ac Khu ngoại vi gồm lớp màng tiểu cầu kết nối với hệ thống các ống mở. Màng rm tiểu cầu gồm hai lớp lipid bao quanh tiểu cầu. Màng tiểu cầu chứa các glycoprotein quan trọng đóng vai trò như các receptor bề mặt liên quan đến quá trình đông máu ha [52]. Glycoprotein Ib (GPIb): là protein xuyên màng có nhiệm vụ liên kết với yếu tố dP wWF giúp cho tiểu cầu dính bám vào collagen. Đây là bước đầu tiên trong hoạt động đông cầm máu của tiểu cầu [18, 29]. Glycoprotein IIb/IIIa (GPIIb/IIIa): là an protein màng, hoạt động phụ thuộc vào ion canxi, có nhiệm vụ liên kết với fibrinogen, giúp cho tiểu cầu ngưng tập tạo thành đinh cầm máu [18, 29]. Ngoài ra, ine các phospholipid điện tích âm, đặc biệt phosphatidylserine (PS) có vai trò quan dic trọng trong quá trình đông máu, là chất nền ban đầu cho các phản ứng enzym tiểu cầu để tạo ra thromboxan A2 (TXA2), sản phẩm quan trọng trong quá trình hoạt Me hóa tiểu cầu và là chất chủ vận mạnh gây nên quá trình ngưng tập tiểu cầu. Màng tiểu cầu cũng có khả năng nhận và chuyển tín hiệu bề mặt thành tín hiệu hóa học of bên trong [17, 52]. ol ho Sc t© gh p yri Co Hình 1.3. Các glycoprotein màng tiểu cầu và chức năng của chúng [29] 7 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
Hệ thống các kênh mở gồm các kênh mở vào trong tiểu cầu như các không bào làm tăng diện tích bề mặt tiểu cầu, các hạt tiểu cầu phóng thích các chất qua hệ thống kênh này [18]. Hệ thống ống dẫn từ trong bào tương của tiểu cầu ra đến lớp màng ngoài, tạo thành các lỗ nhỏ li ti trên bề mặt tiểu cầu. Hệ thống này đóng vai U trò như một đường dẫn cho các chất từ bên ngoài môi trường đi vào trong tế bào VN chất của tiểu cầu và là nơi đưa các chất được giải phóng từ các hạt ra khỏi tiểu cầu khi chúng bị hoạt hóa [7]. y, Khu sol-gel ac Khu sol-gel nằm dưới khu ngoại vi gồm các vi ống và vi sợi. Vi ống nằm sát rm màng tiểu cầu tạo nên khung đỡ và tham gia vào hoạt động co rút khi tiểu cầu bị ha kích thích [52]. Vi sợi gồm các sợi actin có liên hệ chặt chẽ với các vi ống và tham gia vào hoạt động tạo giả túc của tiểu cầu [52]. Ngoài ra khu sol-gel còn chứa dP glycogen [28]. Khu bào quan an Khu bào quan gồm có các loại hạt và thành phần tế bào như các lysosom, ty ine thể… Những bào quan này tham gia vào quá trình trao đổi chất, là nơi dự trữ enzym dic và một lượng lớn các chất khác có vai trò quan trọng với chức năng tiểu cầu [18, 23]. Hạt đặc chứa một số chất như ADP, ATP, GDP, GTP, serotonin, histamin, Me canxi, magie, pyrophosphat, nucleotid khác. Các chất này được giải phóng khi tiểu cầu bị kích thích [18]. Hạt γ-gamma (Túi lysosome) chứa enzym như galactosidase, of fucosidase, hexosaminidase, glucuronidase. Hạt α chứa nhiều protein dính như ol fibrin, fibronectin, vWF, thrombospondin, thromboglobulin, vitronectin; Yếu tố ho phát triển (platelet derived growth factor - PDGF); Peptid hoạt hóa tổ chức liên kết (CTAP: connective tissue activating peptid); Yếu tố 4 tiểu cầu; Yếu tố đông máu: Sc yếu tố V, kininogen, fibrinogen, yếu tố XI, protein S, chất ức chế yếu tố hoạt hóa plasminogen. Hạt λ: làm tan cục máu đông trong giai đoạn sau của sự hồi phục t© mạch [18, 37]. gh Khu vực màng yri Khu vực màng gồm hệ thống ống dày đặc gắn với canxi một cách chọn lọc, p đóng vai trò là nơi dự trữ canxi của tiểu cầu. Đây cũng là nơi tổng hợp men Co cyclooxygenase và prostaglandin của tiểu cầu [52]. 8 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
U VN y, ac rm ha Hình 1.4. Cấu trúc của tiểu cầu [29] dP 1.2.2. Chức năng tiểu cầu Chức năng chính của tiểu cầu là làm vững bền mạch máu, tạo nút cầm máu an ban đầu và tham gia vào quá trình đông máu huyết tương [17, 29]. ine 1.2.2.1. Vai trò của tiểu cầu trong quá trình cầm máu dic Trong trạng thái sinh lý bình thường, tiểu cầu không dính vào nội mô mạch máu còn nguyên vẹn, khi khi tế bào nội mô thành mạch bị tổn thương tiểu cầu Me nhanh chóng trải qua các quá trình thông qua một loạt các phản ứng phối hợp tinh xảo, mà kết quả cuối cùng là hình thành một nút tiểu cầu tại nơi mô tổn thương. of Quá trình chuyển đổi tiểu cầu bất hoạt thành tiểu cầu hoạt hóa xảy ra theo một chiều dọc liên tục nhưng có thể được chia thành các bước: bám dính, kết tập, phóng thích ol ho các chất [7, 18, 23, 35]. Giai đoạn bám dính Sc Tiểu cầu dính vào các bề mặt lạ những tổ chức dưới nội mạc bộc lộ khi mạch t© máu bị tổn thương (in vivo) hoặc bề mặt ống nghiệm thủy tinh, lam kính (in vitro) [17]. Trong thành mạch khỏe mạnh, tiểu cầu được duy trì ở trạng thái không hoạt động gh bởi oxid nitric và prostacyclin từ tế bào nội mô các mạch máu. Tế bào nội mô còn yri chứa ADPase (adenosin diphosphatase) có tác dụng kìm hãm quá trình kích hoạt ADP. Khi thành mạch bị tổn thương, lớp tế bào nội mô bị mất đi và bộc lộ lớp dưới p Co nội mô, lớp này có bản chất là các protein dính như: collagen, yếu tố von Willebrand, fibronectin, lamilin…[7, 41, 52]. Yếu tố vWF tạo điều kiện cho sự bám dính ban đầu, thông qua liên kết với phức hợp GPIb/IX/V đóng vai trò thụ thể trên 9 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
màng tiểu cầu, vWF đóng vai trò quan trọng trong bám dính của tiểu cầu khi tốc độ dòng máu cao. Trong điều kiện tốc độ dòng máu thấp hoặc tĩnh, bám dính ban đầu của tiểu cầu chủ yếu thông qua liên kết collagen với GPIa/IIa. Những tương tác này cho phép tiểu cầu lưu thông chậm lại đủ để có sự tương tác, ràng buộc hơn nữa của U các cặp thụ thể - phối tử dẫn đến sự bám dính tĩnh [7, 35]. Đặc biệt sự tương tác ban VN đầu giữa collagen và GPVI gây ra sự kích hoạt GPIIb/IIIa và GPIa/IIa. vWF và collagen hình thành liên kết mạnh mẽ tương ứng với GPIIb/IIIa và GPIa/IIa, fibrinogen y, liên kết với GPIIb/IIIa giữ tiểu cầu tại chỗ [7, 12]. ac Giai đoạn ngưng tập rm Là hiện tượng tiểu cầu tập trung thành nút qua hiện tượng dính. Hiện tượng ha dính đã hoạt hóa tiểu cầu, tạo điều kiện cho tiểu cầu ngưng tập [18]. Ngưng tập tiểu cầu được đặc trưng bởi sự tích tụ tiểu cầu vào một nút cầm máu. Các thụ thể tiểu dP cầu trung tâm trong quá trình này là GPIIb/IIIa, liên kết các tiểu cầu kích hoạt thông an qua cầu fibrinogen. Một tiểu cầu không hoạt hóa có khoảng 4.000-5.000 phức hợp GPIIb/IIIa trên bề mặt của nó. Trong trạng thái không hoạt động, thụ thể này không ine thể gắn với fibrinogen, vWF, TSP, fibronectin, vitronectin. Chỉ khi tiểu cầu được hoạt hóa, phức hợp GPIIb/IIIa mới được hoạt hóa, hoạt động như một thụ thể dành dic cho fibrinogen, chất này lại gắn với thụ thể trên các tiểu cầu khác tạo nên một cầu nối làm cho các tiểu cầu ngưng tập lại với nhau và tiếp tục hoạt hóa. Hai giai đoạn Me ngưng tập và hoạt hóa tác động qua lại, tương hỗ lẫn nhau diễn ra liên tục cho đến khi tạo thành nút tiểu cầu [7, 29, 35]. of Một số chất có khả năng gây ngưng tập tiểu cầu là: ADP, thrombin, adrenalin, ol serotonin, acid arachidonic, thromboxan A2, collagen, ristocetin..., trong đó ADP ho đóng vai trò quan trọng nhất vì chất này gây ngưng tập tiểu cầu một cách độc lập Sc không phụ thuộc các tác nhân khác và giúp cho phản ứng ngưng tập do các tác nhân khác xảy ra đầy đủ hơn. Ngoài ra, ADP còn có nguồn gốc từ hồng cầu. Những hồng t© cầu tại vị trí thành mạch bị tổn thương sẽ bài tiết ADP và nhờ vậy làm tăng nhanh nồng độ ADP khu trú tại chỗ tổn thương, góp phần làm tăng quá trình ngưng tập tiểu gh cầu, nhanh chóng tạo nút cầm máu ban đầu, làm ngừng chảy máu [17, 29]. yri Sự ngưng tập tiểu cầu gây ra bởi ADP: Bình thường các tiểu cầu không p ngưng tập vì có năng lượng được tạo ra do sự thoái hóa ATP thành ADP. Trong Co trường hợp nồng độ ADP cao thì phản ứng này bị ức chế dẫn đến tiểu cầu bị ngưng tập [23]. 10 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
U VN y, ac Hình 1.5. Cơ chế gây ngưng tập tiểu cầu của ADP [23] rm Acid arachidonic hoạt hóa ngưng tập tiểu cầu làm hoạt hóa phospholipid, ha giải phóng acid arachidonic. Acid arachidonic hoạt hóa men cyclooxygenase (có dP trong hệ thống dày đặc) tạo prostaglandin và thromboxan A2 (thromboxan A2 có tác dụng kích thích ngưng tập tiểu cầu). Thrombin gây ngưng tập tiểu cầu qua cơ an chế tác động lên yếu tố V có trên bề mặt tiểu cầu. Bởi vậy khi dùng men trypsin để thủy phân yếu tố V thì tiểu cầu không còn ngưng tập được nữa [23]. Adrenalin và ine noradrenalin gây ngưng tập tiểu cầu theo cơ chế gián tiếp thông qua việc phóng dic thích ADP và trực tiếp kích thích sự ngưng tập qua vai trò của acid arachidonic [23]. Sự ngưng tập do ristocetin xảy ra do sự kích thích yếu tố von-Willebrand gắn Me với tiểu cầu tại vị trí của receptor GPIb. Vì vậy, nếu thiếu một trong hai yếu tố này thì tiểu cầu không ngưng tập [18, 23]. Serotonin liên kết với thụ thể 5HT2A of khuếch đại cùng với ADP cho phản ứng của tiểu cầu, ngoài ra serotonin có thể đóng vai trò gây đông máu, làm tăng việc lưu giữ protein đông máu như ol ho fibrinogen, thrombospondin trên bề mặt tiểu cầu [7]. Sự ngưng tập tiểu cầu là một hiện tượng có thể phục hồi được tự nhiên. Qúa Sc trình phục hồi này là do sự có mặt của một hệ thống men ở trong huyết tương và t© trong tiểu cầu; trong đó adenylat kinase đóng vai trò quan trọng nhất [23]. Giai đoạn phóng thích các chất của tiểu cầu [23] gh Dưới tác dụng của các yếu tố gây ngưng tập (ADP, thrombin), tiểu cầu sẽ bị yri ngưng tập, tiếp theo sẽ xảy ra một loạt các biến đổi, đó là quá trình thay đổi hình p dạng và phóng thích của tiểu cầu. Đây là một hiện tượng rất phức tạp, bao gồm sự Co biến đổi về hình thái và sinh hóa của tiểu cầu. Cụ thể là những thay đổi về hình thái: tiểu cầu phồng to lên, trải rộng ra, kết dính, ngưng tập, hình thành chân giả, mất hạt, co lại. Sau đó tiểu cầu co rút, giải phóng ra một loạt thành phần như ADP, 11 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
serotonin, adrenalin, histamin, yếu tố III tiểu cầu, 5-hydroxy tryptamin, nucleotid và một số men khác. Các hiện tượng sinh hóa xảy ra như: kích thích chuyển hóa tiêu đường, thoái hóa và tái tổng hợp từng phần ATP, ADP thành AMP, hoạt hóa thrombosterin. Hiện tượng này xảy ra có sự tham gia của thrombin, collagen và có U tiêu tốn năng lượng của tiểu cầu. Đây là hiện tượng vô cùng ý nghĩa trong việc bảo VN vệ mạch máu khi mạch máu bị tổn thương. Trong thực tế, các khả năng kết dính, ngưng tập, phóng thích của tiểu cầu có y, sự gắn bó rất chặt chẽ với nhau, khả năng này thúc đẩy, tạo điều kiện, mở rộng cho ac khả năng khác xảy ra để đạt mục đích cuối cùng là thực hiện tốt các chức năng của rm tiểu cầu. ha dP an ine dic Me of ol ho Hình 1.6. Quá trình ngưng tập tiểu cầu [35] Sc Hiện tượng dính hoạt hóa tiểu cầu, thay đổi hình dạng từ hình đĩa thành dạng quả cầu nhỏ gọn, với phần mở rộng đuôi gai dài tạo điều kiện thuận lợi cho độ bám t© dính. Tiểu cầu ngưng tập, cùng lúc với quá trình này, bên trong tế bào chất của tiểu gh cầu xảy ra hiện tượng giải phóng hạt, các chất chứa bên trong hạt sẽ được giải phóng ra môi trường bên ngoài qua hệ thống kênh mở và thực hiện vai trò sinh học yri của chúng [7, 18, 23]. p 1.2.2.2. Vai trò của tiểu cầu trong quá trình đông máu huyết tương Co Ngay khi hiện tượng bám dính bắt đầu, tiểu cầu thay đổi hình dạng và chế tiết chất tham gia quá trình khởi động đông máu HMWK, yếu tố này cùng với 12 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
kallikrein hoạt hóa yếu tố XII bước đầu của quá trình đông máu. Một lượng nhỏ thrombin được hình thành trên bề mặt của một số tế bào mang TF (tissue factor) như: nguyên bào sợi, bạch cầu đơn nhân hoạt hóa hoặc tế bào nội mô, lượng thrombin này không có khả năng để tạo ra một cục máu đông fibrin ổn định, nhưng U đủ để hoạt hóa tiểu cầu. Sau đó, tiểu cầu hoạt hóa liên kết các yếu tố đông máu bởi VN các thụ thể chuyên biệt. Tiểu cầu liên kết với các yếu tố V và VIII chống lại sự phân cắt bởi hoạt tính protein C. Yếu tố XIa liên kết với thụ thể GPIb trên bề mặt tiểu cầu y, và hoạt hóa yếu tố IX. Yếu tố Xa dễ dàng bị ức chế bởi TF. Sự phối hợp của các ac yếu tố đông máu trên bề mặt tiểu cầu dẫn đến hình thành thrombin, vì vậy một cục rm máu đông ổn định fibrin được hình thành. Ngoài ra tiểu cầu còn cung cấp khoảng 20 % yếu tố V và các yếu tố đông máu khác như fibrinogen, yếu tố IX, XIII [7]. ha 1.3. Các xét nghiệm đánh giá chức năng tiểu cầu dP Hiện nay, có rất nhiều phương pháp đánh giá chức năng tiểu cầu như: đo thời gian máu chảy, đo sức bền mao mạch, đếm số lượng tiểu cầu, co cục máu đông, đo an độ dính tiểu cầu, đo độ ngưng tập tiểu cầu... ine 1.3.1. Thời gian máu chảy dic Nguyên lý là khi mạch máu bị tổn thương, máu sẽ thoát ra ngoài, đồng thời hệ thống cầm máu bắt đầu hoạt động. Hoạt động cầm máu gồm vai trò của thành Me mạch và của tiểu cầu. Chất lượng của hoạt động này không tốt sẽ làm cho thời gian để cầm được máu dài hơn. Xét nghiệm thời gian máu chảy là tạo ra tổn thương of mạch máu và đo thời gian từ lúc máu chảy đến khi máu ngừng chảy [16]. ol Nguyên lý của phương pháp Duke là dùng kim chủng tạo một vết thương ho nằm ngang ở vùng giữa dái tai và đo thời gian máu chảy [12]. Trị số bình thường từ 2 – 4 phút [12, 23]. Sc Nguyên lý của phương pháp Ivy là đo thời gian máu chảy của các vết thương ở t© mặt duỗi cẳng tay, dưới 1 áp suất đã định [12]. Trị số bình thường: 4-8 phút [12, 23]. gh Phương pháp Borchgrevink có trị số bình thường từ 7-10 phút [23] yri 1.3.2. Đo sức bền mao mạch p Có 2 phương pháp, nhưng phương pháp giảm áp ít dùng hơn phương pháp Co tăng áp: dùng huyết áp kế, duy trì lực bằng trung bình cộng giữa huyết áp tối đa và tối thiểu trong vòng 10 phút sau đó tháo hơi nhanh. Đếm số nốt xuất huyết ngay dưới vùng dưới da nếp khuỷu. Nếu trên 7 nốt xuất huyết là dương tính. Sức bền 13 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma