Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học: Nghiên cứu tác dụng của Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) trên sự biểu hiện COX-2, eNOS phosphoryl hóa và một số cơ trơn cô lập

Chia sẻ: Chuheo Dethuong25 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:51

Thêm vào BST

Báo xấu

49
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Khóa luận được nghiên cứu với mục tiêu nhằm bước đầu đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên cơ trơn cô lập của khí quản, bàng quang và thể hang. Đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa và sự tổng hợp NO. Đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu hiện của gen COX-2 và protein COX-2.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học: Nghiên cứu tác dụng của Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) trên sự biểu hiện COX-2, eNOS phosphoryl hóa và một số cơ trơn cô lập

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC HỒ THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA TAM THẤT HOANG (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) TRÊN SỰ BIỂU HIỆN COX-2, eNOS PHOSPHORYL HÓA VÀ MỘT SỐ CƠ TRƠN CÔ LẬP KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC HÀ NỘI – 2018
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC U VN y, HỒ THỊ THU HÀ ac rm ha dP NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA TAM THẤT HOANG (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) an TRÊN SỰ BIỂU HIỆN COX-2, eNOS PHOSPHORYL ine HÓA VÀ MỘT SỐ CƠ TRƠN CÔ LẬP dic Me KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC of ol ho Sc Khóa : QH.2013.Y t© Ngƣời hƣớng dẫn : 1. TS. VŨ THỊ THƠM 2. PGS. TS. DƢƠNG THỊ LY HƢƠNG gh p yri Co Hà Nội - 2018 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến toàn bộ Ban chủ nhiệm khoa Y - Dược, U Đại học Quốc Gia Hà Nội, Bộ môn Dược lý - Dược lâm sàng, Bộ môn Y - Dược VN học cơ sở đã tạo điều kiện cho em để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô đã giảng dạy, giúp đỡ em hoàn thành chương trình y, học tập trong suốt 5 năm qua. ac Em xin bày tỏ sự tri ân và lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Vũ Thị Thơm và rm PGS. TS. Dƣơng Thị Ly Hƣơng, những người đã luôn tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp em hoàn thành khóa luận. Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô Bộ ha môn Dược lý – Dược lâm sàng, thầy cô Bộ môn Y – Dược học cơ sở đã giúp đỡ em dP trong quá trình hoàn thành khóa luận. Em xin cảm ơn chương trình thuộc đề tài Tây Bắc: “Ứng dụng các giải pháp an khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ 2 loài cây thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax ine stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) vùng Tây Bắc”, mã số KHCN-TB.07C/13- dic 18 đã tài trợ kinh phí để em thực hiện được nội dung nghiên cứu này. Em cũng xin cảm ơn Bộ môn Sinh lý học, Học viên Quân Y đã giúp đỡ em thực hiện thí nghiệm. Me Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và người thân đã luôn quan tâm, động viên, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này. of Dù đã rất cố gắng, nhưng lần đầu làm nghiên cứu khó tránh khỏi thiếu sót, ol em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô để khóa luận thêm hoàn thiện. ho Em xin chân thành cảm ơn! Sc t© Hà Nội, tháng 5 năm 2018 Sinh viên gh p yri Co Hồ Thị Thu Hà 3 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Giải thích U ACh Acetylcholin VN BH4 Tetrahydrobiopterin y, CaM Camodulin ac CD Cụm biệt hóa (Cluster of differentiation) rm cGMP GMP vòng (Cyclic guanosine monophosphate) ha COX Cyclooxygenase dP COX-1 Cyclooxygenase-1 COX-2 Cyclooxygenase-2 an ine eNOS Endothelial nitric oxide synthase dic FAD Flavin adenine dinucleotide FMN Flavin mononucleotide Me GTP Guanosine-5'-triphosphate of Tế bào nội mô tĩnh mạch rốn người (Human umbilical vein HUVEC ol endothelial cell) ho ICAM - 1 Phân tử kết dính liên bào 1 (Intercellular adhesion molecule 1) Sc iNOS Inducible nitric oxide synthase t© LD50 Liều gây chết 50% đối tượng thử (Lethal Dose 50%) gh LPS Lipopolyshaccharide yri NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate p nNOS Neuronal nitric oxide synthase Co NO Nitric oxide NOS Nitric oxide synthase 4 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
Thuốc chống viêm không steroid (Non-steroidal anti- NSAIDs inflammatory drugs) NST Nhiễm sắc thể U Yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (Platelet-derived growth PDGF VN factor) PG Prostaglandin y, PGE2 Prostaglandine E2 ac rm PGI2 Prostacyclin ha PS27 Cao giàu saponin Tam thất hoang dP PSBt Cao chiết bằng dung môi n - butanol Tam thất hoang PSnH Cao chiết bằng dung môi n - hexan Tam thất hoang an PST Cao tổng chiết bằng dung môi ethanol 70% Tam thất hoang ine PCR thời gian thực (Reverse transcription polymerase chain RT-PCR reaction) dic Ser Serine Me sGC Guanylyl cyclase hòa tan (Soluble guanylyl cyclase) of Thr Threonin ol TTH Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T. Tsai et K.M.Feng) ho VCAM-1 Phân tử kết dính tế bào mạch (Vascular cell adhesion molecule) Sc t© gh p yri Co 5 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang U VN Hình 1.1 Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. 2 Feng) Hình 1.2 Cấu trúc hóa học các chất 1–15 phân lập từ Panax 3 y, stipuleanatus ac Hình 1.3 Cấu trúc thành động mạch 5 rm ha Hình 1.4 Cấu trúc của eNOS 9 dP Hình 1.5 Sự điều hòa các vị trí phosphoryl hóa eNOS 11 Hình 1.6 Sự tổng hợp NO bởi eNOS và chức năng sinh lý của NO nội 12 mạc an Hình 1.7 Sinh tổng hợp prostaglandin 15 ine Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn Tam thất hoang 18 dic Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất cao giàu saponin từ Tam thất hoang 19 Me Hình 2.3 Phương pháp gắn đoạn cơ trơn vào bình nuôi và hệ thống ghi 20 of Hình 2.4 Sơ đồ phản ứng tạo màu của thuốc thử Griess với NO2- 23 ol Hình 3.1 Sự giãn cơ trơn khí quản của cao tổng Tam thất hoang 25 ho Hình 3.2 Sự giãn cơ trơn cổ bàng quang của cao tổng Tam thất hoang 25 Sc Hình 3.3 Ảnh hưởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự tổng 26 hợp NO t© Hình 3.4 Ảnh hưởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu 27 hiện protein eNOS phosphoryl hóa gh Hình 3.5 Ảnh hưởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu 28 yri hiện mARN COX-2 p Hình 3.6 Ảnh hưởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu 29 Co hiện protein COX-2 6 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang U Bảng 1.1 Các dạng của NOS 8 VN Bảng 3.1 Tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên cơ trơn cô lập 24 y, ac rm ha dP an ine dic Me of ol ho Sc t© gh p yri Co 7 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH U ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 VN CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN..................................................................................... 2 y, 1.1. Tổng quan về Tam thất hoang.................................................................................2 ac 1.1.1. Đặc điểm thực vật ......................................................................................2 rm 1.1.2. Sinh thái và phân bố ..................................................................................2 ha 1.1.3. Thành phần hóa học ...................................................................................3 dP 1.1.4. Tác dụng dược lý .......................................................................................4 1.1.5. Công dụng ..................................................................................................4 an 1.2. Tổng quan về nội mạc mạch máu và eNOS ...........................................................5 ine 1.2.1. Nội mạc mạch máu ....................................................................................5 dic 1.2.2. eNOS..........................................................................................................6 1.3. Tổng quan về viêm và COX-2............................................................................14 Me 1.3.1. Viêm và prostaglandin trong viêm ..........................................................14 of 1.3.2 COX – 2 ...................................................................................................15 ol CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 18 ho 2.1. Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu ................................................................18 Sc 2.1.1. Nguyên liệu ..............................................................................................18 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu ..............................................................................19 t© 2.2. Dung môi, hóa chất và thiết bị............................................................................20 gh 2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................21 yri 2.3.1. Nghiên cứu tác dụng trên cơ trơn cô lập..................................................21 p Co 2.3.2. Nghiên cứu sự biểu hiện của COX-2 và eNOS phosphoryl hóa .............22 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 24 3.1. Kết quả ................................................................................................................24 8 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
3.1.1. Tác dụng trên cơ trơn cô lập ....................................................................24 3.1.2. Tác dụng trên sự biểu hiện eNOS phosphoryl hóa ..................................26 3.1.3. Tác dụng trên sự biểu hiện COX-2 ..........................................................28 U 3.2. Thảo luận ............................................................................................................30 VN 3.2.1 Tác dụng trên cơ trơn cô lập ....................................................................30 y, 3.2.2. Tác dụng trên sự biểu hiện eNOS phosphoryl hóa ..................................31 ac 3.2.3. Tác dụng trên sự biểu hiện của COX-2 ...................................................33 rm KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................................... 35 ha TÀI LIỆU THAM KHẢO dP an ine dic Me of ol ho Sc t© gh p yri Co 9 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
ĐẶT VẤN ĐỀ Nội mạc mạch máu là một lớp tế bào nội mô mỏng nằm lót mặt trong của lòng mạch [1]. Các tế bào này có khả năng sản xuất ra nitric oxid (NO), một chất giãn U mạch quan trọng và có nhiều vai trò trong điều hòa chức năng sinh lý của mạch máu VN như trương lực mạch, sự kết tập tiểu cầu, sinh mạch, sự kết dính bạch cầu – nội mô… Tại nội mạc mạch máu, NO được tổng hợp nhờ các enzym nitric oxide synthase ở nội y, mạc (eNOS - Endothelial nitric oxide synthase). Hoạt động của enzym này được điều ac khiển bởi nhiều cơ chế trong đó có quá trình phosphoryl hóa eNOS [41,69]. Viêm là rm một trong những nguyên nhân gây rối loạn chức năng nội mạc [67]. Rối loạn chức năng nội mạc có liên quan đến NO, phosphoryl hóa eNOS và quá trình viêm đã được ha báo cáo trong nhiều bệnh lý tim mạch như xơ vữa động mạch, cao huyết áp…[24,37]. dP Trong những năm gần đây, sự điều hòa eNOS thông qua quá trình phosphoryl hóa đang là một mục tiêu y học triển vọng trong điều trị nhiều bệnh lý [41]. an Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng ) thuộc chi Panax L., ở nước ta cây chỉ có ở vùng núi cao thuộc dãy Hoàng Liên Sơn [9]. ine Nghiên cứu bước đầu về thành phần hóa học cho thấy trong rễ và lá của Tam thất dic hoang có chứa saponin với hàm lượng cao [6]. Đặc biệt, saponin trong các loài thuộc chi Panax L. đã được chứng minh có tác dụng giãn cơ trơn, tăng tổng hợp Me NO, tăng biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa [39,73] và chống viêm [32,45,58]. Tuy nhiên, đến nay các nghiên cứu về loài này vẫn còn hạn chế. Điều này đặt ra câu of hỏi liệu với thành phần giàu saponin, Tam thất hoang có những tác dụng kể trên hay ol không? Để làm sáng tỏ điều đó, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tác dụng của ho Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) trên sự biểu hiện COX-2, eNOS phosphoryl hóa và một số cơ trơn cô lập” với ba mục tiêu: Sc 1. Bước đầu đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên t© cơ trơn cô lập của khí quản, bàng quang và thể hang. 2. Đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu gh hiện của eNOS phosphoryl hóa và sự tổng hợp NO. yri 3. Đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu p hiện của gen COX-2 và protein COX-2. Co 1 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Tam thất hoang U Tam thất hoang có tên khoa học là Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. VN Feng, thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae), chi Panax L.; hay còn được gọi với các tên khác như Tam thất rừng, Bình biên tam thất, Thổ tam thất [2,8]. y, 1.1.1. Đặc điểm thực vật ac Cây thân thảo cao 25 – 75 cm; thẫn rễ mập, nằm ngang, có nhiểu vết lõm do rm vết thân để lại, ít phân nhánh. Mỗi khóm thường có 1 thân mang lá, ít khi 2 – 3 lá. Lá kép chân vịt, gồm 1 – 3 cái, mọc vòng ở ngọn; cuống dài 5 – 10 cm. Lá chét 5, ha có cuống ngắn, hình thuôn hay mác thuôn, dài 5 – 13 cm, rộng 2 – 4 cm, nhọn hai dP đầu, cuống hoa dài 1 – 1,5 cm. Hoa màu vàng xanh với 5 lá đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 2 ô. Quả mọng, gần hình cầu dẹp, đường kính 0,6 – 1,2 cm, khi chín màu an đỏ. Hạt gồm 1 hoặc 2 hạt màu xám trắng (Hình 1.1) [2]. ine dic Me of ol ho Sc t© Hình 1.1. Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) [11] 1.1.2. Sinh thái và phân bố gh Tam thất hoang (TTH) ưa ẩm và sáng. Cây mọc rải rác trên đất có nhiều yri mùn, dưới tán rừng kín thường xanh, ở độ cao 1600 – 2300 m. Tái sinh bằng hạt. Ra p hoa tháng 4 – 5, có quả tháng 5 – 9. Cho đến nay, trên toàn thế giới, loài này mới Co chỉ tìm thấy ở tỉnh Vân Nam (Trung Quốc) và một vài điểm ở Vườn Quốc gia Hoàng Liên Sơn thuộc tỉnh Lào Cai, Việt Nam [2,9]. 2 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
1.1.3. Thành phần hóa học Trong thân rễ của TTH chứa các saponin khung oleanan (hầu hết đều là saponin dẫn chất acid oleanolic) với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp [19]. U VN Năm 1985, từ dịch chiết methanol của thân rễ TTH đã phân lập được 2 saponin dẫn chất của acid oleanolic là stipuleanosid R1và stipuleanosid R2 [19]. y, Năm 2002, nhóm nghiên cứu của Đại học Toyama, Nhật Bản phân tích thành ac phần dịch chiết ethanol của TTH thu hái ở Trung Quốc đã xác định được một hàm lượng rm nhỏ các saponin khung dammaran gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd [43]. Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Chun Liang và cộng sự đã phân lập được ha 11 hợp chất saponin là dẫn chất của acid oleanolic, trong đó có một chất mới là dP spinasaponin A methyl ester từ rễ TTH thu hái ở Việt Nam [15]. Năm 2013, nhóm tiếp tục xác định được thêm 4 hợp chất saponin khung oleanan khác [45]. Ngoài ra an 3 polyacetylen, 1 sesquiterpen và 1 acid béo cũng được phân lập [15] (Hình 1.2). ine dic Me of ol ho Sc t© gh Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của 15 chất phân lập từ P. stipuleanatus [45] yri Tại Việt Nam, các nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự chỉ ra trong p TTH ngoài saponin còn có thành phần khác như: polyacetylen, triterpenoid, tinh Co dầu, đường khử, acid hữu cơ, acid polyuronic, acid béo, acid amin và các nguyên tố vi lượng [5,6]. 3 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
1.1.4. Tác dụng dƣợc lý Trên thế giới, năm 2010, từ 11 hợp chất saponin phân lập được từ TTH (1 – 11, hình 1.2) nhóm nghiên cứu của Chun Liang đã tiến hành thử tác dụng gây độc trên các tế bào ung thư bạch cầu cấp tiền tủy bào (HL-60) và ung thư ruột kết người U (HCT-116) thu được kết quả: Chất 1 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đáng kể với VN giá trị IC50 lần lượt là 4,44 và 0,63 µM trên 2 dòng tế bào HL-60 và HCT-116 [15]. Năm 2013, Chun Liang và cộng sự tiếp tục đánh giá hoạt tính của 15 chất (1 – 15, y, hình 1.2) lên yếu tố nhân kappa B (NF-κB) trên tế bào HepG2 cho kết quả: Các chất ac từ 6 – 11 ức chế NF-κB với IC50 từ 3,1 – 18,9 µM. Các chất 8, 10 và 11 ức chế sự rm biểu hiện của mARN iNOS (inducible nitric oxide synthase) và COX-2 (cyclooxygenase-2) phụ thuộc nồng độ. Điều này đem lại tiềm năng trong điều trị ha như là chất chống viêm, chống xơ vữa động mạch và chống loạn thần [45]. dP Năm 2011, 2 polyacetylen mới được phân lập từ TTH là stipudiol và stipuol ức chế đáng kể sự tăng sinh của tế bào ung thư HL-60 và HCT-116 thông qua kích an hoạt quá trình apotosis của tế bào [46]. ine Tại Việt Nam, nghiên cứu của Trần Công Luận năm 2002 cho thấy: Cao TTH có tác dụng phục hồi thời gian ngủ do stress, đưa về trạng thái bình thường ở dic các mức liều thử 44; 88 và 176 mg/kg. Ở các nồng độ 25; 50 và 100 μg/ml cao Me saponin toàn phần của TTH có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành malonyl dialdehyd. Cao thân rễ và rễ củ TTH thể hiện độc tính cấp đường uống với of liều LD50 = 8,8 g/kg [5]. ol Nghiên cứu của Lê Thị Tâm và Nguyễn Thị Tuyết Trinh (2016) cho kết quả ho TTH có tác dụng chống đông và ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro [7,11]. Sc 1.1.5. Công dụng Sách đỏ Việt Nam (2007) có ghi “Tất cả các bộ phận của cây đều có công t© dụng làm thuốc; thân rễ thường được dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh dục, chống stress. Lá, nụ hoa dùng làm trà uống có tác dụng kích thích tiêu hóa, an gh thần”. TTH có tác dụng tán ứ, định thống. Bộ phận dùng là thân rễ Rhizoma yri Panacis Stipuleanati [2]. p Co 4 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
1.2. Tổng quan về nội mạc mạch máu và eNOS 1.2.1. Nội mạc mạch máu 1.2.1.1 Đặc điểm cấu trúc U Về giải phẫu học từ trong ra ngoài, thành động mạch có cấu tạo gồm 3 lớp áo VN đồng tâm: Lớp áo ngoài là lớp vỏ xơ, có các sợi thần kinh chi phối; lớp áo giữa gồm những sợi cơ trơn và sợi đàn hồi; lớp áo trong là lớp tế bào nội mô (Hình 1.3) [3]. y, ac rm ha dP an ine Hình 1.3. Cấu trúc thành động mạch [1] dic Tương tự như thành động mạch, thành tĩnh mạch, mao mạch và mạch bạch huyết cũng có một lớp tế bào nội mô lợp mặt trong lòng mạch. Lớp nội mô thuộc biểu Me mô lát đơn, gồm một hàng tế bào nội mô hình đa giác dẹt, có phần bào tương chứa nhân lồi vào trong lòng mạch, phần bào tương ở ngoại vi tỏa thành lá mỏng. Các tế bào of nội mô liên kết với nhau bằng những dải bịt hoặc liên kết khe [1]. Ở người trưởng ol thành, nội mạc mạch máu gồm khoảng mười ngàn tỷ (1013) tế bào, bao phủ một diện ho tích khoảng 1 - 7 m2 hình thành nên một tổ chức nặng khoảng 1 kg [27,52]. Sc 1.2.1.2. Chức năng của nội mạc mạch máu Nội mạc mạch máu có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự lưu thông t© dòng máu, trương lực mạch máu, sự kết tập tiểu cầu cũng như tham gia điều hòa các quá trình viêm, miễn dịch, sinh mạch, chuyển hóa và duy trì sự hằng định nội môi gh [30]. Các tế bào nội mô thực hiện cả hai chức năng trao đổi chất và tổng hợp [52]. yri Nội mạc mạch máu hình thành nên một hàng rào bán thấm kiểm soát sự di p chuyển của các chất hòa tan, các đại phân tử và cả các tế bào giữa dòng máu với các Co mô xung quanh [27,30]. Irie và Tavassoli gọi đó là hàng rào máu – mô [65]. Rối loạn tính thấm nội mạc có thể gây ra nhiều bệnh lý như phù, sốc, xung huyết. 5 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
Các tế bào nội mô có khả năng sản xuất ra nhiều phân tử khác nhau như các chất giãn mạch: nitric oxide (NO), prostacyclin (PGI2), EDHF (yếu tố cường phân cực có nguồn gốc nội mô/ endothelium-derived hyperpolarizing factor); các chất co mạch: Endothelin, thromboxan A2, angiotensin II; các phần tử kết dính: E-selectin, U P-selectin, ICAM -1 (phân tử kết dính liên bào/ intercellular adhesion molecule) và VN VCAM-1 (phân tử kết dính tế bào mạch/ vascular cell adhesion molecule); cytokin và yếu tố tăng trưởng: GM-CSF (Yếu tố kích thích quần thể bạch cầu hạt – đại thực y, bào/ Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), interleukin (IL-1, IL-6) ac và SCF (Yếu tố tế bào gốc/ Stem cell factor); các chemokin: α và β chemokin, rm fractalkin; các yếu tố liên quan đến quá trình cầm máu: t-PA (yếu tố hoạt hóa plasminogen mô), PAI-1 (chất ức chế yếu tố hoạt hóa plasminogen), yếu tố ha Willebrand, thromboxan A2, NO, PGI2, TF (yếu tố mô), TFPI (chất ức chế con dP đường yếu tố mô); hay các yếu tố liên quan đến sự tăng sinh cơ trơn và sinh mạch: VEGF (yếu tố tăng trưởng nội mạc mạch/ vascular endothelial growth factor), an PDGF (yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu/ platelet derived growth factor) [17,26,27,38]. ine Rối loạn về cấu trúc cũng như chức năng nội mạc mạch máu liên quan đến dic nhiều quá trình bệnh lý như xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, bệnh động mạch vành, suy tim mạn, bệnh mạch ngoại vi, tiểu đường, tăng áp lực phổi, nhiễm khuẩn Me và các hội chứng viêm [26,27]. 1.2.2. eNOS of 1.2.2.1. Nitric oxide ol ho Năm 1980, Furchgott và Zawadzki đã chứng minh được rằng sự giãn của động mạch thỏ khi kích thích bằng acetylcholin (ACh) cần sự có mặt của nội mô Sc nguyên vẹn và ACh đã kích thích sự giải phóng của một chất được gọi là yếu tố giãn mạch nguồn gốc nội mạc (Endothelium derived relaxing factor – EDGR). Năm t© 1987, Palmer và cộng sự đã xác định được yếu tố đó là nitric oxide (NO) [25]. Ngày gh nay, NO được biết đến là một trong những gốc khí tự do đơn giản nhất và đóng vai trò tín hiệu trung gian quan trọng trong cơ thể [41]. NO tham gia điều hòa nhiều quá yri trình sinh lý như sự dẫn truyền thần kinh, trương lực mạch máu, sự co cơ, kết tập p tiểu cầu, chuyển hóa, đáp ứng miễn dịch, phiên mã gen và dịch mã mARN, quá Co trình biến đổi sau dịch mã của protein [25,69]. 6 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
Về đặc điểm cấu trúc và tính chất, NO là một gốc khí tự do nhỏ nặng 30 Dalton, không màu và nhiệt độ nóng chảy khoảng 163,6 °C, trong cấu trúc của NO có một electron chưa ghép cặp [25,60]. NO có khả năng phản ứng với các nguyên tố kim loại chuyển tiếp để hình thành nên nitrosyl kim loại, đây là đặc U tính quan trọng trong con đường tín hiệu của nó. Mặt khác, NO tan kém trong VN nước, có thể dễ vượt qua được màng tế bào để tham gia điều hòa các quá trình sinh lý. Tuy nhiên, chất này không bền có thời gian bán thải (T1/2) ngắn và bị y, chuyển hóa nhanh trong cơ thể [25]. ac Trong cơ thể NO được tổng hợp qua hai con đường: thông qua các enzym rm NOS (Nitric oxide synthase) hoặc từ quá trình khử của NO2-. NOS là enzym xúc tác cho phản ứng hình thành NO và L-citrullin từ L-arginin và O2 [69]. Ở động vật có ha vú, NOS có ba dạng chính, mã hóa bởi các gen riêng biệt trên nhiễm sắc thể (NST) dP khác nhau: NOS thần kinh (nNOS) hay NOS loại 1; NOS do cảm ứng (iNOS) hay NOS loại 2 và NOS nội mạc (eNOS) hay NOS loại 3 (Bảng 1.1). Con đường thứ hai an để hình thành NO là từ phản ứng khử NO2-, phản ứng này được tạo điều kiện bởi enzym NO2- reductase như các enzym chứa molypden (xanthin oxidase), NOS và ine nhiều thành phần của chuỗi vận chuyển điện tử ti thể. Phản ứng khử NO2- đóng vai dic trò quan trọng trong trường hợp thiếu oxy khi đó hoạt động của NOS bị giới hạn. Trong cơ thể NO được chuyển hóa bằng quá trình oxy hóa để hình thành nên NO2- Me và NO3-. Quá trình này có thể tự xảy ra (autooxidation) hoặc được xúc tác. Một phần NO bị bất hoạt trong stress oxy hóa, NO kết hợp với superoxid (O2-) để hình of thành nên peroxynitrit (ONOO-) [25,69]. ol ho Sc t© gh p yri Co 7 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
Bảng 1.1. Các dạng của NOS [13,69] NOS - 1 NOS – 2 NOS - 3 Tên phổ nNOS iNOS eNOS U biến (Neuronal NOS) (Inducible NOS) (Endothelial NOS) VN Neuron thần kinh và Nhiều loại tế bào hệ Tế bào nội mô một số tế bào khác. thống miễn dịch như đại thực bào khi đáp y, Tế bào ac ứng với biểu hiện lipopolysaccharid rm (LPS), cytokin và các ha chất khác. NST 12, gồm 29 exon NST 17, 26 exon NST 7, 26 exon dP Gen Đặc điểm Enzym cấu trúc Enzym cảm ứng Enzym cấu trúc an Ở hệ thần kinh trung Tham gia vào sinh lý Tham gia vào ương: có liên quan bệnh của quá trình nhiều chức năng ine đến quá trình học tập viêm và hệ thống tim mạch quan dic Chức năng và ghi nhớ; kiểm soát miễn dịch trọng: Giãn mạch, và các quá huyết áp trung ương. ức chế các quá Me trình sinh Ở hệ thần kinh ngoại trình như kết tập học vi: Chất dẫn truyền tiểu cầu, kết dính of thần kinh, giãn cơ trơn bạch cầu, tăng sinh và mạch của tế bào cơ trơn ol thành mạch. ho Sc 1.2.2.2. eNOS t© eNOS (Endothelial nitric oxide synthase) là một trong 3 dạng của NOS. NO gh sản xuất tại nội mô bởi eNOS là một hợp chất vận mạch quan trọng, tham gia điều hòa nhiều quá trình sinh lý đặc biệt liên quan đến chức năng tim mạch. eNOS biểu yri hiện chủ yếu trong tế bào nội mô, ngoài ra enzym này cũng được phát hiện trong tế p bào cơ tim, tiểu cầu, neuron ở não, hợp bào lá nuôi của nhau thai người và trong tế Co bào biểu mô ống thận LLC-PK1 [69,70]. 8 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
Cấu trúc gen và protein eNOS được mã hóa bởi một gen nằm trên nhiễm sắc thể số 7 (7q35–7q36); có cấu trúc gồm 26 exon, gen này chiếm một đoạn khoảng 21 – 22 kb [13,66,70]. Về cấu trúc, eNOS là một protein chứa 1203 acid amin, nặng 133 kDa, có dạng U homodimer gồm 2 domain (Hình 1.4) [13,70]: VN - Domain reductase nằm ở đầu –COOH, chứa vị trí gắn của NADPH y, (Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), FAD (Flavin adenine ac dinucleotide) và FMN (Flavin mononucleotide). - Domain oxygenase nằm ở đầu –NH2 chứa vị trí gắn của BH4 rm (Tetrahydrobiopterin), hem và L-arginin. ha - Hai domain này được gắn kết với nhau bởi một trình tự dài khoảng 30 acid amin chứa vị trí gắn của Camodulin (CaM). dP an ine dic Me Hình 1.3. Cấu trúc của eNOS (Ser: Serine; Thr: Threonin) [29] Phosphoryl hóa eNOS of Hoạt động của eNOS được điều khiển bởi 2 cơ chế đó là cơ chế phụ thuộc ol Ca và không phụ thuộc Ca2+: 2+ ho Cơ chế phụ thuộc Ca2+: eNOS là một enzym phụ thuộc Ca2+/CaM. Khi nồng Sc độ Ca2+ nội bào tăng, tạo điều kiện cho CaM gắn được vào vị trí của nó trên eNOS. CaM là protein đầu tiên tương tác với eNOS, sự gắn của CaM làm dịch chuyển điện t© tử từ NADPH ở domain reductase đến hem ở domain oxygenase thông qua FAD và gh FMN. Tại vị trí hem các điện tử được dùng để khử và hoạt hóa O2 từ đó oxi hóa L- arginin thành L-citrullin và NO. Các yếu tố thiết yếu cần cho eNOS chức năng bao yri gồm L-arginin, Fe, BH4, NADPH, FAD và FMN [69]. p Phosphoryl hóa eNOS: Phosphoryl hóa eNOS là một biến đổi sau dịch mã, Co được điều khiển bởi hệ thống các kinase, phosphatase và tương tác protein – protein và đây là một trong những cơ chế tham gia điều khiển eNOS. Mặc dù hoạt động của eNOS phụ thuộc vào nồng độ Ca2+ nhưng đây không phải là yếu tố duy nhất cần 9 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
cho sự điều hòa hoạt động của enzym này. Sự gắn của CaM và sự dịch chuyển của dòng các điện tử từ domain reductase đến domain oxygenase của enzyme cũng phụ thuộc vào sự phosphoryl hóa và khử phosphoryl hóa eNOS [41]. Các nghiên cứu chỉ ra rằng, sự phosphoryl hóa eNOS xảy ra tại Serin (Ser) và ở một mức độ thấp U hơn trên Tyrosin (Tyr) và Threonin (Thr). Ở người, phosphoryl hóa Ser1177, Ser617 VN và Ser633 làm kích hoạt eNOS trong khi phosphoryl hóa tại Thr495 và Ser114 làm giảm chức năng eNOS. Sự phosphoryl hóa eNOS có thể được điều hòa bởi nhiều y, yếu tố như “shear stress”, yếu tố tăng trưởng tế bào nội mô mạch máu (VEGF), ac bradykinin, insulin, estrogen… làm hoạt hóa các enzym khác nhau như serin/ rm threonin kinase Akt, CaMKII (Ca2+/ calmodulin dependent protein kinase II), AMPK (AMP-activated protein kinase), PKA (protein kinase A) và gây phosphoryl ha hóa eNOS tại các vị trí khác nhau (Hình 1.5) [29,34,41]. dP Ngoài ra, hoạt động của eNOS còn được điều khiển bởi sự tương tác với các protein như Hsp90 hay Caveolin-1. Cav-1 (Caveolin-1) là protein vỏ chính của an caveolae tại tế bào nội mô, cav-1 gắn với eNOS và kết quả là làm bất hoạt eNOS [59]. Hsp90 (Protein shock nhiệt 90) làm tăng hoạt động của eNOS theo cơ chế điều ine hòa dị lập thể, nghiên cứu cho thấy sự hình thành phức hợp eNOS – Hsp90 ở tế bào dic nội mô khi bị kích thích bởi histamin, bradykinin, yếu tố tăng trưởng nội mạc và “shear stress” làm tăng hoạt tính của eNOS lên 3 lần [31]. Sự tương tác của eNOS với Me 2 protein này đều là những cơ chế điều hòa hoạt tính của eNOS độc lập với Ca2+. of ol ho Sc t© gh p yri Co 10 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
U VN y, ac rm ha dP Hình 1.5. Sự điều hòa các vị trí phosphoryl hóa eNOS. Các vị trí eNOS phosphoryl hóa được đánh số theo thứ tự eNOS người/ bò [41] an (VEGF: Vascular endothelial cell growth factor/ Yếu tố tăng trưởng tế bào nội mô mạch máu; 8-Br-cAMP: 8-bromoadenosine-3’,5’- monophosphate vòng; S-1-P: ine sphingosine 1-phosphate; PMA: phorbol 12-myristate 13-acetate; HDL: high- density lipoprotein/ lipoprotein trọng lượng phân tử cao; S: Serin; T: Threonin; ) dic 1.2.2.3. Chức năng sinh lý của eNOS và NO nội mạc Me a. Điều hòa trương lực mạch máu Tại nội mạc NO được tạo ra bởi eNOS làm hoạt hóa guanylyl cyclase hòa tan of (sGC/ soluble guanylyl cyclase) kích hoạt con đường truyền tin cGMP (GMP ol vòng). sGC xúc tác cho phản ứng chuyển GTP (Guanosine-5'-triphosphate) thành ho cGMP là một chất truyền tin thứ hai, cGMP hoạt hóa các protein kinase G (PKG), thúc đẩy quá trình phosphoryl hóa các protein kết quả là làm giảm nồng độ Ca2+ nội Sc bào và giãn mạch (Hình 1.6) [25]. Nghiên cứu cho thấy huyết áp tăng ở nhóm chuột t© bị xóa bỏ gen eNOS [47]. b. Ức chế sự kết dính bạch cầu và viêm mạch máu gh NO kiểm soát sự biểu hiện của các gen liên quan đến xơ vữa động mạch. NO yri làm giảm sự biểu hiện của protein hóa hướng động bạch cầu mono MCP-1 p (Monocyte chemoattractant protein-1) [56], ức chế sự kết dính của bạch cầu với Co thành mạch bằng cách can thiệp vào khả năng gắn của các phân tử kết dính bạch cầu CD11/ CD18 (Cụm biệt hóa/ Cluster of differentiation) với bề mặt tế bào nội mô hoặc ức chế sự biểu hiện của CD11/ CD18 ở bạch cầu. Sự kết dính bạch cầu là 11 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma